基因工程

nbsp; 1.1  基因工程概貌
    1.1.1  基因工程的诞生和兴起
    1.1.2  基因工程的特点与基本步骤
    1.1.3  基因工程早期的开创性研究成就
  1.2  基因工程技术的应用与发展趋势
    1.2.1  全球性的基因工程争夺战
    1.2.2  蛋白质工程的研究开发飞速发展
    1.2.3  转基因动植物生产药物的研究迅速崛起
    1.2.4  医学科学研究取得巨大成就
    1.2.5  基因治疗技术取得重大进展
    1.2.6  规模空前的国际《人类基因组计划》提前完成
  1.3  基因工程与生物制药
    1.3.1  基因工程制药发展态势
    1.3.2  主要基因工程药物简介
2  基因工程常用的工具酶
  2.1  限制性核酸内切酶
    2.1.1  限制酶的发现
    2.1.2  限制酶的种类
    2.1.3  限制酶的命名
    2.1.4  Ⅱ型限制酶的特性
    2.1.5  限制片段末端连接
  2.2  DNA连接酶
    2.2.1  DNA连接酶连接作用的特点
    2.2.2  基因工程中常用的连接酶
    2.2.3  DNA连接酶连接作用的分子机理
  2.3  DNA聚合酶
    2.3.1  大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
    2.3.2  K1enow大片段酶
    2.3.3  T4噬茵体DNAR聚合酶
    2.3.4  经修饰的T7噬茵体DNA聚合酶
    2.3.5  TaqDNA聚合酶及Ampli TaqTMDNA聚合酶
    2.3.6  反转录酶
  2.4  DNA修饰酶
    2.4.1  末端脱氧核苷酸转移酶
    2.4.2  碱性磷酸酶
    2.4.3  T4噬菌体多核苷酸激酶
  2.5  单链核酸内切酶
    2.5.1  Sl核酸酶
    2.5.2  Bal31核酸酶
  2.6核酸外切酶
    2.6.1  核酸外切酶Ⅶ
    2.6.2  核酸外切酶Ⅲ
    2.6.3  λ核酸外切酶
3  基因工程常用的克隆载体
  3.1  质粒载体
    3.1.1  质粒概述
    3.1.2  质粒DNA分子的特性
    3.1.3  质粒载体的改造和构建
    3.1.4  DBR322质粒载体
    3.1.5  DUC质粒载体
    3.1.6  其他重要的质粒载体
  3.2  λ噬菌体载体
    3.2.1  λ噬菌体的基本特性
    3.2.2  λ噬菌体基因组的结构与功能
    3.2.3  λ噬菌体载体的构建
    3.2.4  常用的λ噬菌体载体
    3.2.5  改良型λ噬菌体载体
  3.3  粘粒载体
    3.3.1  粘粒载体的构建
    3.3.2  粘粒载体的特点
    3.3.3  常用的粘粒载体
  3.4  M13噬菌体载体
    3.4.1  M13噬菌体的基本特性
    3.4.2  M13噬菌体载体的构建
    3.4.3  M13噬茵体载体系列的优点
  3.5  噬菌粒载体
    3.5.1  pUC118和pUCll9噬菌粒载体
    3.5.2  pBluescript噬菌粒载体
  3.6  哺乳动物细胞载体系统
    3.6.1  SV40载体
    3.6.2  牛乳头瘤病毒（BPV）载体
    3.6.3  EBV病毒载体
4目的基因的制取
  4.1  目的基因的化学合成
    4.1.1  目的基因的设计
    4.1.2  寡聚核苷酸片段的合成
    4.1.3  寡核苷酸片段的分离和纯化
    4.1.4  用寡核苷酸片段组装目的基因
    4.1.5  化学合成寡核苷酸的其他用途
  4.2  构建基因文库法分离目的基因
    4.2.1  构建基因文库法分离目的基因的基本步骤
    4.2.2  真核基因组DNA文库的构建过程
  4.3  酶促合成法制取目的基因
    4.3.1  真核生物细胞中的mRNA
    4.3.2  从构建的cDNA文库中筛选目的cDNA
    4.3.3  RT-PCR法合成目的cDNA
5  目的基因与克隆载体的体外重组
  5.1  目的基因与质粒载体的连接
    5.1.1  粘性末端连接法
    5.1.2  定向克隆法
    5.1.3  平末端连接法
    5.1.4  同聚物加尾法
    5.1.5  加人工接头连接法
    5.1.6  加DNA衔接物连接法
    5.1.7  其他转换末端形式连接法
  5.2  目的基因与入噬菌体载体的连接
    5.2.1  λ噬茵体载体臂DNA的制备
    5.2.2  λ噬菌体载体臂与外源目的DNA片段的连接
6  重组克隆载体引入受体细胞
  6.1  基因工程受体细胞
    6.1.1  受体细胞的特性
    6.1.2  重组体分子导入受体细胞的途径
  6.2  重组体DNA分子的转化或转染
    6.2.1  用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法
    6.2.2  用复合剂制备感受态细胞转化法
    6.2.3  高压电穿孔转化法（电转化法）
  6.3  重组λ噬菌体DNA的体外包装与转导
    6.3.1  λ噬茵体体外包装的基本原理
    6.3.2  λ噬菌体DNA的体外包装
    6.3.3  包装提取物的制备
    6.3.4  重组λDNA的体外包装与感染方法
  6.4  重组克隆载体导人哺乳动物细胞的转染
    6.4.1  磷酸钙和DNA共沉淀物转染法
    6.4.2  DEAE-葡聚糖介导转染法
    6.4.3  利用Polybrene（聚季铵盐）的DNA转染法
    6.4.4  利用原生质体融合的DNA转染法
    6.4.5  电穿孔法DNA转染
7  含目的基因重组体的筛选、鉴定与分析
  7.1  重组体（菌）的筛选
    7.1.1  抗生素抗性基因插入失活法
    7.1.2  β-半乳糖苷酶基因插入失活法
    7.1.3  快速细胞破碎与凝胶电泳筛选法
    7.1.4  放射性标记核酸探针杂交筛选法
    7.1.5  免疫化学筛选法
  7.2  重组体的鉴定
    7.2.1  酶切及凝胶电泳鉴定法
    7.2.2  Southern印迹杂交法
    7.2.3  电镜R-环检测法
    7.2.4  基因产物鉴定法
  7.3  重组DNA的序列分析
    7.3.1  sanger-双脱氧链终止法DNA测序
    7.3.2  Maxam-Gilbert化学修饰法DNA测序
    7.3.3  快速自动化DNA测序
8  目的基因在宿主细胞中的表达
  8.1  外源目的基因在原核细胞中的表达
    8.1.1  原核基因表达载体的构成
    8.1.2  常见的原核细胞表达载体系统
    8.1.3  外源目的基因在原核细胞的表达形式
    8.1.4  在原核细胞中高效表达目的基因
    8.1.5  基因定点诱变技术
  8.2  外源目的基因在真核细胞中的表达
    8.2.1  真核细胞表达载体的功能元件
    8.2.2  酵母茵表达系统
    8.2.3  哺乳动物细胞表达系统
9  基因工程药物无性繁殖系的组建
  9.1  人胰岛素原融合蛋白重组菌的组建
    9.1.1  重组表达质粒pJG202的构建与鉴定
    9.1.2  重组质粒pJG202在大肠杆菌中的表达
    9.1.3  融合蛋白后处理成为人胰岛素原
  9.2  人a2b型干扰素工程菌的组建
    9.2.1  hIFN-a2b基因的获得
    9.2.2  重组表达质粒pMZI2B的构建
    9.2.3  人a2b型干扰素工程菌的形成与基因的表达
  9.3  集落刺激因子工程菌的组建
    9.3.1  细胞总RNA的提取
    9.3.2  PCR引物的设计与合成
    9.3.3  RT-PCR法制备GM-CSF cDNA
    9.3.4  GM-CSF重组表达载体与工程菌的组建
  9.4  白细胞介素融合蛋白工程菌的组建
    9.4.1  质粒与PCR引物
    9.4.2  人IL-2 cDNA和PE基因的末端改造
    9.4.3  IL2-PE-pLY5重组质粒的构建
  9.5  乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建
    9.5.1  BsAg基因重组表达质粒pLS1和pLS2的构建
    9.5.2  重组表达质粒的转化及HBsAg的表达
    9.5.3  重组表达质粒在酵母细胞中的稳定性
  9.6  人组织型纤溶酶原激活剂细胞株的组建
    9.6.1  真核表达质粒pLFrGGI的构建
    9.6.2  高效表达FrGGI（tPA突变体）的CHO细胞株的获得
    9.6.3  去除dhfr基因转录增强子的作用
  9.7  红细胞生成素CHO细胞株的组建
    9.7.1  质粒与细胞株
    9.7.2  EPO真核重组表达质粒pMGL4的构建
    9.7.3  重组表达质粒转染COS-7细胞及产物表达
    9.7.4  重组表达质粒转染CHO-dhfr-细胞及EPO表达
  9.8  人肿瘤坏死因子昆虫细胞株的组建
    9.8.1  含hTNF-a基因的重组质粒的构建
    9.8.2  共转染与重组病毒的获得
    9.8.3  重组病毒感染Sf2l细胞及hTNF-a的表达
10  基因工程药物的生产
  10.1  基因工程菌（细胞）的培养与发酵
    10.1.1  工程细菌的培养与发酵
    10.1.2  工程酵母的培养与发酵
    10.1.3  工程细胞的培养与发酵
  10.2  基因工程药物的分离纯化
    10.2.1  影响分离纯化工艺设计的主要因素
    10.2.2  各种产物表达形式采用的分离纯化方法
  10.3  基因工程药物的分离纯化实例
    10.3.1  以包涵体形式表达的rGM-CSF中试分离纯化
    10.3.2  以分泌型表达的人a1-干扰素的分离纯化
    10.3.3  以可溶性形式表达的rhG-CSF的分离纯化
    10.3.4  在酵母中表达的HBsAg的分离纯化
11  基因工程药物的检验
  11.1  基因工程药物的质量控制
    11.1.1  主要的基因工程药物
    11.1.2  基因工程药物的特点
    11.1.3  基因工程药物的质量要求
    11.1.4  基因工程药物的质控要点
    11.1.5  基因工程药物的制造及检定规程
  11.2  基因工程药物常用的检验方法
    11.2.1  化学检定法
    11.2.2  肽图分析法
    11.2.3  外源性DNA残留量的测定
    11.2.4  宿主细胞蛋白杂质的检测
    11.2.5  无菌试验
    11.2.6  内毒素试验
    11.2.7  异常毒性试验
    11.2.8  热原质试验
    11.2.9  生物学活性（效价）检定
  11.3  主要基因工程药物的检验
    11.3.1  重组人胰岛素的检验
    11.3.2  重组人生长激素的检验
    11.3.3  重组人干扰素的检验
    11.3.4  重组人白细胞介素的检验
    11.3.5  重组人红细胞生成素的检验
    11.3.6  重组人集落刺激因子的检验
    11.3.7  重组人组织型纤溶酶原激活剂的检验
    11.3.8  重组人肿瘤坏死因子的检验
    11.3.9  重组乙型肝炎疫苗的检验
附录
参考文献