基因工程实验技术教程

     目 录
   绪论
   本教程基因工程实验流程图
   实验一 碱法抽提质粒DNA
    一 实验目的
    二 实验原理
    （一）克隆载体pUC118质粒与宿主菌MV1184
    1pUC118质粒结构
    2MV1184宿主菌F＇因子基因型
    3MV1184宿主菌染色体基因型
    （二）质粒DNA的抽提
    1裂解细胞
    2分离
    3纯化
    （三）碱法抽提的主要试剂
    （四）抽提产量与试剂用量的估算
    1抽提产量估算
    2试剂用量估算
    三 试剂与器材
    四 实验步骤
   实验二 电泳法测定DNA的浓度与纯度
    一 实验目的
    二 实验原理
    （一）琼脂糖凝胶
    （二）电泳时DNA迁移的影响因素
    1DNA分子质量的影响
    2DNA构型的影响
    3胶浓度的影响
    4电场强度的影响
    5溴乙锭的影响
    6电泳缓冲液的影响
    7碱基组成与电泳温度的影响
    （三）电泳缓冲液
    1TAE
    2TBE
    3TPE
    （四）上样液
    （五）上样量的控制
    （六）DNA电泳条带的检测
    （七）电泳的分子质量梯度标志
    1线状分子质量梯度标志
    2超螺旋分子质量梯度标志
    三 试剂与器材
    四 实验步骤
   实验三 载体与供体DNA的酶切
    一 实验目的
    二 实验原理
    （一）限制性内切酶的一般性质
    1一般限制酶的识别位点
    2识别超长碱基序列的酶
    3各类粘性末端的特点
    4同识别序列的酶
    5酶切反应中的位点优先现象
    6DNA构型对酶切的影响
    7近末端切割
    8酶的星号反应
    9大肠杆菌中甲基化现象对酶切的影响
    10能切割单链的限制酶
    （二）限制性内切酶的使用
    1制作基因图谱
    2克隆基因
    3制备探针
    （三）酶切方式
    1部分酶切
    2完全酶切
    （四）酶的质量鉴定
    （五）酶的保存
    （六）酶单位的定义
    （七）限制酶的作用条件
    1作用温度
    2缓冲体系
    3反应时间
    4DNA的纯度与浓度
    （八）终止酶反应的方法
    （九）酶切失败的原因及处理的方法
    三 试剂与器材
    四 实验步骤
   实验四 目的基因片段的回收
    一 实验目的
    二 实验原理
    （一）各类回收方法
    1电泳回收法
    2收集孔电泳回收法
    3机械破碎凝胶回收法
    4溶（熔）胶回收法
    5琼脂糖酶降解凝胶回收法
    （二）回收方法的选择与操作注意事项
    三 试剂与器材
    四 实验步骤
   实验五 载体与供体DNA的连接
    一 实验目的
    二 实验原理
    （一）早期的连接理论
    （二）近期的计算机模拟反应进程
    （三）连接酶
    （四）连接反应的影响因素
    1连接缓冲液的影响
    2pH值的影响
    3ATP浓度的影响
    4连接温度与时间的影响
    5酶浓度的影响
    6DNA浓度的影响
    7DNA序列的影响
    8其他抑制因素的影响
    （五）三种连接酶单位定义
    1Weiss单位
    2d（A—T）环化单位
    3粘性末端单位
    三 试剂与器材
    四 实验步骤
   实验六 CaCl2法转化大肠杆菌
    一 实验目的
    二 实验原理
    （一）各种转化方法与转化率的衡量指标
    （二）转化率的影响因素
    1试剂（包括水）纯度与器皿清洁程度的影响
    2接种前菌种保存方式的影响
    3宿主菌生长时期的影响
    4CaCl2法0℃放置时间的影响
    5化合物与无机离子的影响
    6质粒大小、构型与复制起点的影响
    7竞争DNA的影响
    8共转化质粒的影响
    9质粒DNA与转化细胞比例的影响
    10菌株基因型recA＋与recA 的影响
    11连接缓冲液的影响
    （三）大肠杆菌中的限制系统与限制修饰系统
    1Mcr限制系统
    2Mrr限制系统
    3hsd限制修饰系统
    （四）宿主菌的选择
    三 试剂与器材
    四 实验步骤
   实验七 酚/氯仿法快速鉴定转化子
    一 实验目的
    二 实验原理
    （一）DNA水平检测
    1快速抽提电泳分析
    2快速抽提酶切分析
    3原位杂交法
    4斑点杂交法
    5Southern杂交法
    6DNA序列分析
    （二）mRNA水平检测
    1R环电子显微镜法检测
    2杂交抑制翻译
    3杂交选择翻译
    （三）蛋白质水平检测
    1沉淀免疫检测法
    2其他免疫检测法
    （四）功能水平检测
    三 试剂与器材
    四 实验步骤
   实验八 随机引物法标记DNA探针
    一 实验目的
    二 实验原理
    （一）酶法标记于链上
    1缺口转移法
    2随机引物法
    3PCR法
    （二）酶法标记于末端
    13′末端标记法
    25＇末端标记法
    （三）化学法标记于链上
    1直接标记法
    2介导标记法
    （四）化学法标记于末端
    1合成时引入氨基或巯基
    2合成后引入氨基或巯基
    （五）光化学法标记于链上
    1芳香叠氮化合物
    2呋喃香豆素衍生物
    （六）人工合成于链上
    1掺入碱基类似物
    2掺入核糖类似物
    （七）检测酶直接标记法
    1检测酶直接标记于链上
    2检测酶直接标记于末端
    三 试剂与器材
    四 实验步骤
   实验九 菌落原位吸印
    一 实验目的
    二 实验原理
    （一）各类吸印膜
    1硝酸纤维素膜（NC膜）
    2叠氮氧苄甲基纤维素纸（DBM纸），重氮苯硫醚
    纤维素纸（DPT纸）和氨基苯硫醚纤维素纸（APT
    纸）
    3二乙氨基乙基纤维素纸（DEAE纸）
    4ECTELA纸
    5尼龙膜
    6聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）
    7其他膜
    （二）各种转移方法
    1毛细管转移法
    2真空转移法
    3电转移法
    三 试剂与器材
    四 实验步骤
   实验十 DNA分子杂交
    一 实验目的
    二 实验原理
    （一）DNA的复性与杂交反应动力学方程式
    1双链DNA的复性过程
    2单链探针的杂交过程
    3双链探针的杂交过程
    （二）杂交速率的影响因素
    1探针分子复杂性的影响
    2探针分子浓度的影响
    3杂交温度的影响
    4杂交液pH值的影响
    5杂交液中离子强度的影响
    6杂交液中甲酰胺浓度的影响
    7杂交促进剂的影响
    （三）杂交反应的两种模式
    （四）杂交分子稳定性的影响
    1杂交液中Na＋离子浓度的影响
    2探针分子中GC％的影响
    3杂交液中甲酰胺浓度的影响
    4探针分子长度的影响
    5与目标DNA错配的影响
    6杂交液pH值的影响
    （五）杂交的步骤
    三 试剂与器材
    四 实验步骤
   实验十一 显色法检测杂交结果
    一 实验目的
    二 实验原理
    （一）酶法显色原理
    1辣根过氧化物酶
    2碱性磷酸酯酶
    （二）免疫法检测原理
    （三）生物素－亲和素法检测原理
    （四）其他检测法
    1胶体金标记——银加强检测法
    2时间分辨荧光检测法
    三 试剂与器材
    四 实验步骤
   实验十二 PCR法鉴定人的性别
    一 实验目的
    二 实验原理
    （一）PCR的引物设计
    1引物的长度
    2引物的GC％含量
    3引物的3′端起始碱基
    4引物无回文对称结构
    5引物自身不能配对
    6两个引物的Tm值
    7两个引物之间不能配对
    （二）PCR的反应体系
    1模板DNA
    2引物
    三 分光光度计的使用
    四 电泳仪的使用
    五 微量移液器的使用
    六 凝胶摄影
    七 酚的重蒸与饱和处理
    八 RNA酶的使用与预处理
    九 缓冲液作用原理与Tris·Cl的配制
    十 菌种与DNA样品的保存
    十一 器皿的清洗处理
    十二 器皿和试剂的灭菌处理
    十三 器皿的硅化处理
    十四 大肠杆菌常用基因型
   参考文献