现代毒理学实验技术原理与方法

第一章离体器官的灌流技术1
第一节离体肺灌流技术1
一、仪器装备1
二、灌流液体1
三、通气气体2
四、操作步骤2
五、毒理学应用举例2
六 、注意事项3
第二节离体心脏灌流技术3
一、仪器装置4
二、灌流液的配制5
三、心脏灌流的应用实例6
第三节离体肝脏灌流技术6
一、仪器装置7
二、灌流液的配制8
三、离体肝脏灌流程序8
四、灌流肝脏可用性的鉴定8
五、离体肝脏灌流的应用及实例9
第四节人胎盘灌流技术10
一、胎盘灌流11
二、结果及计算13
三、锌的体外人胎盘灌流研究15
主要参考文献17
第二章细胞毒理学研究方法20
第一节细胞培养20
一、培养细胞生物学20
二、细胞培养技术21
三、常用几种细胞的培养26
第二节培养细胞的生物特征与检测29
一、培养细胞的常规观察29
二、细胞染色体分析31
三、培养细胞恶性转化35
四、大鼠气管上皮细胞转化试验38
五、鸡胚绒毛膜（抗）新生血管形成试验40
主要参考文献43
第三章组织学方法45
第一节光镜和电镜的制片技术45
一、光镜切片的制备45
二、常用组织学染色法48
三、电镜超薄切片的制备51
第二节酶组织化学技术53
一、水解酶53
二、氧化酶与过氧化物酶59
三、脱氢酶和一氧化氮合酶61
第三节免疫组织（细胞）化学技术63
一、荧光标记免疫组织化学法64
二、酶标记免疫组织化学法65
三、金标记免疫组织化学法69
四、免疫电子显微镜技术71
主要参考文献73
第四章细胞凋亡常用的研究方法74
第一节概述74
第二节细胞凋亡的形态学评价76
一、倒置显微镜和光学显微镜观察法76
二、荧光显微镜观察法77
三、透射电子显微镜观察79
第三节细胞凋亡时质膜的改变80
一、磷脂酰丝氨酸外化分析（Annexin V联合PI法）80
二、Hoechst 33342/PI双染色法81
第四节细胞凋亡时DNA的改变81
一、DNA Ladder测定81
二、大分子染色体DNA片段的测定83
三、凋亡细胞DNA含量的流式细胞仪分析84
四、DNA片段原位标记85
五、凋亡细胞断裂核小体DNA的免疫化学测定88
第五节细胞凋亡时线粒体膜电位变化的检测89
一、线粒体跨膜电位的检测89
二、与线粒体膜电位有关的因素90
第六节其他90
一、Caspase3活性的检测90
二、PARP活性的测定93
三、人类凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析94
四、凋亡相关基因的检测95
主要参考文献96
第五章亚细胞组分的制备与功能检测97
第一节细胞膜的制备97
一、红细胞膜的分离与鉴定97
二、肝细胞膜的分离与鉴定99
三、脑突触体膜的分离制备101
第二节肾小管和小肠上皮细胞刷状缘膜的制备102
一、肾小管上皮细胞刷状缘膜的分离与鉴定102
二、小肠上皮细胞刷状缘膜的分离与鉴定106
第三节线粒体的分离制备107
一、脑线粒体的分离及鉴定108
二、心脏线粒体的分离制备109
三、肝脏线粒体的分离制备109
四、肾脏线粒体的分离制备110
第四节微粒体的制备及微粒体酶系的测定110
一、微粒体的分离制备110
二、微粒体混合功能氧化酶系活性的测定111
第五节溶酶体和过氧化氢酶体的分离制备112
一、原理112
二、仪器与试剂112
三、分离技术113
四、溶酶体纯度鉴定113
主要参考文献114
第六章蛋白质（酶）的分离与纯化116
第一节蛋白质（酶）的粗分离116
一、细胞破碎和蛋白质（酶）的溶剂提取方法116
二、盐析方法118
三、有机溶剂沉淀方法121
第二节蛋白质（酶）的层析纯化122
一、吸附层析方法122
二、离子交换层析方法122
三、凝胶过滤层析方法124
四、亲和层析方法127
五、金属螯合层析方法130
第三节电泳技术分离纯化蛋白质（酶）132
一、醋酸纤维素电泳132
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳134
三、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳136
主要参考文献138
第七章蛋白质（酶）的功能测定139
第一节酶的功能测定139
一、胆碱酯酶的活性测定　140
二、O6烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶的测定143
三、超氧化物歧化酶的测定145
四、细胞色素P450单加氧酶测定146
五、乳酸脱氢酶同功酶测定148
六、附：蛋白质定量测定（Lowry法）149
第二节蛋白质受体功能的测定151
一、受体放射分析法151
二、基因重组检测系统152
第三节蛋白加合物测定153
一、血红蛋白加合物的测定154
二、白蛋白加合物的测定155
第四节蛋白质（酶）功能研究新进展157
一、质谱技术157
二、酵母双杂交技术158
三、蛋白芯片技术159
主要参考文献160
第八章分子毒理学基本技术162
第一节核酸的印迹杂交162
一、核酸杂交的基本原理——核酸的变性和复性162
二、核酸杂交的重要工具——核酸探针163
三、常用的核酸分子杂交技术165
第二节蛋白质印迹杂交169
一、蛋白质样品的制备169
二、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳170
三、蛋白质的电转移171
四、蛋白质的杂交172
第三节聚合酶链式反应173
一、参与PCR反应体系的因素及其作用174
二、PCR反应温度和循环次数176
三、常用的几种PCR反应177
第四节基因的序列测定179
一、双脱氧链末端终止法179
二、化学（裂解）法181
第五节重组DNA技术181
一、基因工程的重要工具——酶类182
二、基因工程的重要工具——载体183
三、获得目的基因185
四、目的基因与载体的连接187
五、重组子导入受体菌189
六、重组子的筛选与鉴定189
七、重组体在宿主细胞中表达与调控190
八、表达产物——蛋白质的分离与纯化193
主要参考文献194
第九章分子毒理学技术的应用195
第一节单细胞凝胶电泳技术195
一、检测机理195
二、实验程序及方法195
三、结果评价197
四、SCGE实验中的注意事项197
五、SCGE在毒理学中的应用198
第二节荧光原位杂交（FISH）技术199
一、基本原理199
二、FISH技术的发展199
三、毒理学研究中应用的FISH技术201
四、FISH技术中的注意事项202
五、FISH操作举例202
第三节PCRSSCP技术203
一、基本原理204
二、基本实验过程204
三、影响因素205
四、银染显色法205
五、PCRSSCP分析在毒理学中的应用206
第四节mRNA差异显示PCR技术206
一、基本原理207
二、主要操作步骤及注意事项207
三、该技术的不足之处及弥补办法208
四、mRNA差异显示法在毒理学中的应用209
主要参考文献209
第十章基因芯片技术210
第一节基因芯片的原理和合成方法210
一、基因芯片的原理210
二、基因芯片的离片合成法210
三、基因芯片的在片合成法211
四、基因芯片的基质212
五、基因芯片的微排列制作212
六、基因芯片的生化反应212
七、基因芯片的结果检测与分析213
第二节基因芯片的分类213
一、载体材料分类213
二、点样方式分类214
三、DNA种类分类214
四、用途分类215
五、新近发展的两种芯片技术215
第三节基因芯片的广泛应用216
一、在基础医学研究方面的应用216
二、在药物筛选方面的应用217
三、在指导用药方面的应用217
四、在临床诊断方面的应用217
五、在卫生毒理学研究中的应用217
六、在其他方面的应用219
主要参考文献219
第十一章信号传递与细胞通讯220
第一节细胞间缝隙连接通讯的检测220
一、划痕标记染料示踪技术（SLDT）220
二、显微注射染料示踪技术222
三、代谢合作检测法224
第二节细胞膜受体的分离与纯化225
一、概述225
二、受体溶脱226
三、受体纯化228
第三节第二信使系统230
一、磷脂酶A2230
二、蛋白激酶C活性测定232
三、环核苷酸233
四、三磷酸肌醇的检测234
五、一氧化氮及合酶的测定235
六、二酰甘油的测定241
七、细胞内pH值的测定243
主要参考文献245
第十二章免疫毒理学方法246
第一节B淋巴细胞功能检测方法246
一、空斑形成细胞检测方法246
二、血清溶血素测定249
第二节T淋巴细胞功能检测方法250
一、小鼠外周血T淋巴细胞酸性α醋酸萘酯酶（ANAE）染色法250
二、T淋巴细胞亚群的检测252
三、T淋巴细胞增殖功能测定254
四、迟发型超敏反应试验256
第三节巨噬细胞功能测定256
一、巨噬细胞非特异性吞噬功能测定257
二、巨噬细胞Fc受体功能检测258
三、肿瘤坏死因子（TNF）的测定260
四、一氧化氮生成的测定261
第四节中性粒细胞和NK细胞活性测定262
一、中性粒细胞吞噬功能的测定262
二、NK细胞活性的测定262
第五节细胞因子的测定264
一、白细胞介素1（IL1）的检测264
二、白细胞介素2（IL2）的检测265
第六节过敏反应和自身免疫266
一、皮肤致敏试验266
二、小鼠耳肿胀试验268
三、耳淋巴结试验268
四、窝淋巴结实验269
第七节宿主抵抗力试验270
一、肿瘤细胞攻击试验271
二、对细菌的抵抗试验272
三、对旋毛虫螺旋体的抵抗试验274
主要参考文献275
第十三章行为毒理学方法276
第一节动物行为评价方法276
一、一般行为毒理学方法276
二、行为致畸学方法279
三、神经科学的发展与行为毒理学283
第二节人的行为功能评价方法289
一、发展概况289
二、研究方法290
主要参考文献292
第十四章毒理学指标的统计分析方法294
第一节联合作用的统计方法294
一、比值法294
二、效应图解法295
三、等概率和曲线法295
四、Logistic图解法297
第二节存活寿命表的统计指标299
一、存活寿命表的统计指标299
二、计算步骤300
第三节生殖发育试验的统计指标301
一、试验动物与剂量301
二、生殖发育的统计指标301
三、数据处理和结果评价302
第四节致突变试验的统计指标302
一、概述302
二、实例305
第五节致癌试验的数学模式示例307
一、几项指标307
二、实例307
第六节行为毒理学308
第七节毒理学相关学科的统计分析指标310
一、数据类型310
二、体重与器官重量311
三、临床化学312
四、血液学313
五、组织病理学损害的发生率314
第八节样品与染毒方式的统计问题315
一、经食物和空气染毒分析315
二、悬浮颗粒物统计量315
第九节对毒理学数据处理中常见错误的分析317
一、统计学结论的描述性错误318
二、随机分组不均衡318
三、非参数资料不能用参数统计方法分析318
四、配对关系318
五、计量资料中方差是否整齐及计数资料中样本是否足够大319
六、有顺序关系的计数资料319
七、有效数字的取舍319
主要参考文献320
第十五章毒理学良好实验室规范322
一、概述322
二、良好实验室规范323
三、附言326
主要参考文献326