PCR聚合酶链反应

原理篇
第1章 PCR技术基本原理3
1.1 基本原理3
1.2 PCR反应动力学5
1.3 PCR技术的特点6
1.4 PCR反应体系的组成6
1.5 PCR所需设备和器材9
参考文献9
第2章 PCR技术的发展11
2.1PCR新技术的发展11
2.2其他核酸扩增技术的发展15
参考文献18
第3章 PCR技术在医学研究领域中的应用19
3.1 PCR在医学检验中的应用19
3.2 对PCR技术医学应用的正确认识21
3.3 PCR技术在医学应用中的管理22
参考文献23
操作方法/技术篇
第4章 常规PCR27
4.1 常规PCR反应体系说明27
4.2 PCR操作27
4.3 PCR条件优化48
参考文献55
第5章 反转录PCR57
5.1 RTPCR原理57
5.2 RNA的提取和纯化60
5.3 RTPCR的操作66
5.4 衍生技术——基因表达系列分析82
参考文献85
第6章 实时荧光定量PCR87
6.1 原理87
6.2 实验操作与优化89
6.3 实时定量PCR数据分析93
6.4 qPCR的常用软件——PrimerExpress99
6.5 qPCR仪的选择107
参考文献112
第7章 免疫PCR115
7.1 原理115
7.2 实验操作121
7.3 条件优化125
参考文献128
第8章 利用PCR构建突变体131
8.1 定点突变131
8.2 随机诱变PCR144
8.3 衍生技术147
参考文献155
第9章 未知序列的克隆157
9.1 RNA连接酶介导的cDNA5′末端快速扩增157
9.2 单侧特异性引物扩增未知DNA序列161
9.3 反向PCR163
参考文献166
第10章 其他医学领域常见PCR技术167
10.1 PCR技术应用于病原微生物检测鉴定167
10.2 遗传性疾病诊断的常用PCR技术175
10.3 PCR技术在肿瘤方面的应用182
10.4 甲基化特异性PCR186
参考文献193
第11章 PCR软件使用195
11.1 Oligo6的使用197
11.2 PerlPrimer的使用206
11.3 引物在线设计210
常见问题解答
1 为什么完全没有PCR扩增产物？215
2 为什么除目的条带外，还出现多条非特异扩增条带？215
3 为什么目的条带未出现但有非特异扩增条带出现？216
4 为什么PCR产物很少？216
5 为什么同一批PCR反应中包括阴性对照在内的平行管出现相同的阳性结果？216
6 为什么PCR产物出现片状拖带或涂抹带？216
7 如何提高PCR的保真度？217
8 如何减少PCR污染？217
9 如何特异扩增极微量的目的基因片段？217
10 如何确定最适退火温度？217
11 如何进行长片段PCR扩增？218
12 如何提高PCR的特异性？219
13 RNA制备过程中如何避免RNase污染？219
14 进行RNA相关实验时，塑料制品.玻璃和金属物品需要怎么处理？219
15 什么时候需要分离mRNA?220
16 如何判定分离的总RNA的纯度？220
17 提取RNA时什么时候需要加入RNA载体?220
18 如何除去纯化的RNA中微量的基因组DNA?220
19 纯化的RNA样品如何保存？220
20 组织和细胞样品如何收集和保存？220
21 如何估计RNA的产量？220
22 RNA制备过程中哪个环节要特别注意？221
23 RTPCR要求模板RNA的260nm/280nm的值最低为多少，如果太低是不是会影响结果？221
24 RTPCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？221
25 如何选择RTPCR的方法？221
26 RTPCR的常用内标猹瞐ctin和GAPDH的使用是否有选择性，比如不同的细胞.不同的刺激？221
27 如何确定PCR的线性期？222
28 引物的特异退火温度怎样设定？是否可以根据GC和AT含量算出？
是否可以用引物报告单上的Tm值？222
29 PCR时20霯体系中cDNA应加多少比较合适？MgCl2应加多少？
各个成分的量有无确定标准？20霯是指体积还是量?222
30 PCR结果进行电泳，actin有，但无其他目的条带，有几种原因？是否与cDNA的量少有关？Mg2+太多是否会抑制Taq酶的活性？223
31 RTPCR的引物如何设计？223
32 如何确认RNA的质量？224
33 RTPCR中的定量如何控制？225
34 RTPCR的实验设计需注意哪些事项？225
35 RTPCR结果可以代替蛋白表达的结果吗？226
36 DNA残留是否会影响RTPCR？226
37 RTPCR定量测定中产物长度是否有限制？226
38 RTPCR中内参照的意义是什么？226
39 RTPCR中应选择什么作为内参照？226
40 RTPCR定量实验中的凝胶成像要注意什么？226
41 提取RNA时沉淀RNA步骤要注意什么？227
42 RNA的保存要注意什么？227
43 从临床样品中提取RNA有哪些注意事项？227
44 PCR基因诱变的意义是什么？227
45 定点突变时，转化率低或仅能得到很少菌落怎么办？227
46 怎么解决定点突变中低突变率的问题？228
47 如何避免PCR定点诱变中出现的假阳性问题？228
48 怎样控制PCR随机基因突变的突变率？228
49 在随机突变PCR后，看不到目的DNA产物条带怎么办？228
50 QFPCR实验中无CT值（信号）出现是什么原因?229
51 QFPCR中CT值出现过晚是什么原因？229
52 QFPCR中标准曲线的线性关系不佳是什么原因?229
53 QFPCR中阴性对照也出现明显的扩增是什么原因?230
54 QFPCR中熔解曲线不止一个主峰是什么原因?230
55 QFPCR中扩增效率低是什么原因?230
56 QFPCR中实验重复性不好是什么原因?230
57 如何知道QFPCR中变性温度是否合适?230
58 QFPCR中如何选择变性时间?230
59 QFPCR中如何知道退火温度和时间是否合适?231
60 QFPCR中应该在哪一步读取荧光信号?231
61 与常规的5′RACE相比，RMLRACE有什么特点?231
62 IPCR的主要用途是什么?231
63 PCRSSCP实验中有哪些注意事项？232
64 如何优化多重PCR反应？233
65 原位PCR要注意哪些问题？234
66 PCR测序实验要注意哪些事项？236
67 MSP与常规PCR有何不同？236
68 为何有些组织DNA样品在MSP中同时出现甲基化和非甲基化两种结果？236
69 MSP中如何设置对照？236
70 采用软件设计的引物是否一定比自己根据经验设计的引物好？237
附录
附录1 临床基因扩增检验实验室管理暂行办法241
附录2 临床基因扩增检验实验室基本设置标准245
附录3 临床基因扩增检验实验室工作规范247