丝状真菌分子细胞生物学与实验技术

前言
第一章 丝状真菌基因型特征的鉴定
1 概述
2 基因组变异的主要特征
3 确定研究目的
4 用于基因组分析的技术
5 假设
6 选择最佳策略
方案1 链格孢真菌的RAPD分析
7 AFLP技术的原理及其应用
方案2 丝状真菌的AFLP分析
方案3 丝状真菌的cDNA-AFLP
8 变性梯度凝胶电泳(DGGE)
方案4 土壤中真菌的DGGE分析
9 重要的数据库和互联网资源
第二章 丝状真菌核酸的提取与分析
1 概述
2 基因组DNA的分离
方案1 CTAB法提取真菌基因组DNA
方案2 氯化苄(benzyl chloride)法提取真菌基因组DNA
方案3 丝状真菌总DNA的分离
方案4 固体平板上菌小量DNA的块速提取(以稻瘟病菌为例)
方案5 真菌小量DNA的快速提取
3 丝状真菌RNA的提取
4 RNA的操作
方案6 Trizol法提取丝状真菌总RNA
方案7 丝状真菌总RNA的提取
方案8 真菌总RNA的小量提取(Trizol法)
第三章 丝状真菌的DNA转化
1 概述
2 选择性标记和转化载体
3 待转化DNA的质量
4 DNA的进入
5 REMI转化
方案1 稻瘟病菌(Maggna porthe grisea)原生质体的制备及转化
方案2 毛壳菌原生质体的制备
6 真菌ATMT转化
方案3 感受态农杆菌细胞的制备与转化
方案4 利用农杆菌转化真菌
7 电击转化
方案5 Tapesia yallundae的电击转化
8 转化DNA的命运
方案6 丝状真菌中的质粒拯救
方案7 农杆菌电击转化感受态的制备与转化
第四章 丝状真菌的遗传分析
1 子囊菌遗传分析
方案1 对真菌孢子进行化学诱变
方案2 对真菌的孢子进行紫外诱变
方案3 营养缺陷型突变体的筛选与鉴定
方案4 温度敏感型突变群体的制备
方案5 单孢分离
方案6 构巢曲霉的八分体分析
方案7 通过准性重配确定里连锁群
方案8 稻瘟病菌温度敏感型突变体的筛选
2 担子菌遗传分析
方案9 鬼伞菌在人工培养条件子实体和担孢子的产生
方案10 通过CHEF凝胶电泳分离C.cinereus的染色体
方案11 C.cinereus的四分体分离
方案12 C.cinereus粉孢子的紫外诱变
方案13 利用NT、G(MNNG)/EMS对担子菌进行诱变
方案14 平板印迹
附：担子菌研究中的标准培养基
第五章 丝状真菌的基因组分析
1 概述
2 遗传图谱
方案1 克隆固定大小的基因组DNA作为RFLP探针
方案2 RAPD操作要点
3 电泳核型分析
方案3 琼脂糖栓中制备完整染色体DNA
方案4 琼脂糖栓电泳
方案5 钳位均匀电场电泳
4 物理图谱
方案6 染色体DNA的RecA-AC
方案7 准备BAC载体DNA
方案8 准备BAC插入DNA
方案9 BAC插入DNA大小的选择，恢复和克隆
方案10 将文库克隆排列到杂交膜上
方案11 收集克隆文库
5 筛选文库
方案12 Southern杂交分析混合文库和克隆阵列文库
6 染色体步移(chromosome walking)
方案13 BAC或者黏粒末端RNA探针的合成
方案14 根据插入片段末端序列制备的探针
7 真菌基因组分析相关数字资源
第六章 真菌发育过程的细胞学分析
1 概述
2 丝状真菌生长的测定
方案1 菌丝顶端生长的测定
方案2 菌落生长速度的测定
方案3 直线生长速率的测定
3 丝状真菌孢子的萌发
方案4 真菌孢子的萌发测定
4 稻瘟病菌细胞生物学分析
方案5 稻瘟病菌产孢培养、孢子收集和附着胞诱导培养
方案6 稻瘟病菌侵染过程的组织病理学观察
方案7 稻瘟病菌孢子、附着胞内脂质体、糖原的观察
方案8 细胞自噬现象的观察
方案9 酒精氧化酶活性测定
方案10 冷冻替代用于电子显微镜观察
方案11 细胞核，细胞壁和隔膜的染色
第七章 丝状真菌的信号传导
1 概述
2 蛋白抽提
方案1 构巢曲霉(Aspergillus nidulans)蛋白激酶的抽提
3 蛋白免疫沉淀反应
方案2 NIMA在大肠埃希菌(E.coli)中的表达和His-tag亲和纯化
方案3 蛋白质免疫沉淀(IP)
4 凝胶阻滞试验(gel-shift assay)检测蛋白的磷酸化状态
方案4 NIMA磷酸化状态的凝胶忸滞试验
5 蛋白激酶的底物特异性分析
方案5 NIMA激酶分析
第八章 丝状真菌的细胞生物学技术
1 电子显微镜工作原理及其应用
2 扫描电子显微镜样品制备的原理与方法
3 透射电子显微镜样品制备的原理与方法
4 电镜细胞化学技术
5 免疫组化技术
第九章 丝状真菌的生化研究方法
1 概述
2 抽提物的准备
方案1 菌丝的摇瓶培养
方案2 疏水蛋白的分离
3 细胞组分的准备
方案3 细胞膜的分离
方案4 脉孢霉的液泡分离
方案5 线粒体的分离
方案6 细胞核的分离
方案7 细胞核的抽提
方案8 微体的分离
4 蛋白分析
方案9 孢子和菌丝的小量的蛋白质抽提
方案10 从固体培养物中分离胞外酶(N.crassa的脂肪酶)
方案11 从新鲜菌丝分离细胞内蛋白，适用于蛋白水解敏感蛋白的方法
方案12 从新鲜菌丝分离细胞内蛋白
方案13 从冻干菌丝分离胞内蛋白
方案14 酶学分析的代谢物抽提
第十章 真菌研究中的免疫学方法
1 概述
2 免疫原分子的特性
方案1 免疫抗原的准备
3 制备多克隆抗血清
方案2 用辛酸和硫酸铵沉淀法纯化抗体
方案3 用ELISA测定pAb的滴度和检验上清液中的mAb
4 制备单克隆抗体
方案4 通过B细胞-骨髓瘤细胞融合制取鼠科杂种瘤细胞
方案5 荧光免疫检测
方案6 限制性稀释法亚克隆
方案7 冷冻法长期储存的杂交瘤细胞
方案8 应用抗原介导ELISA鉴定Ig类别/亚类
5 蛋白质和糖类抗原决定簇的特性
方案9 通过化学和酶学修饰确定的抗原决定簇的特性
6 其他经常使用的免疫学分析方法
方案10 间接DAS-ELISA
7 抗体的提供及其商业发展
第十一章 丝状真菌的功能基因组分析
1 构建稻瘟病菌突变子库
2 目标突变技术
3 cDNA文库构建及测序分析
方案1 构建附着胞cDNA文库的cDNA的合成
4 cDNA文库构建及筛选
方案2 cDNA文库构建
方案3 质粒pTriplEx2的插入片段的验证
5 抑制差减杂交技术
方案4 稻瘟病菌附着胞SSF{差减文库的构建
6 丝状真菌细胞自噬及其研究方法
方案5 稻瘟病菌中细胞自噬研究方法
方案6 稻瘟病菌细胞自噬研究中的其他相关显微观察
方案7 双分子荧光互补技术
方案8 蛋白质电泳(Tricine-SDS-PAGE)及蛋白质印迹杂交
方案9 酵母双杂交系统研究蛋白互作
方案10 细胞表达目的蛋白
7 真菌中结合PCR(Double-Joint PCR)基因融合片段操作
8 真菌RNAi技术的应用
第十二章 丝状真菌分子进化与系统发育分析
1 概述
2 系统发育分析方法
方案1 木霉菌的ITS rDNA的PCR扩增
方案2 木霉菌的tef 1-α基因的PCR扩增
方案3 木霉菌进行RAPD研究
方案4 AFLP技术
3 构建系统发育树
第十三章 丝状真菌群体遗传分析
1 纯培养条件下真菌群体遗传分析
方案1 Pot2-rep-PCR
方案2 MGR586-RFLP
2 免培养技术用于环境中真菌群体的遗传结构分析
方案3 土壤真菌DNA的直接提取
方案4 土壤样品中真菌总DNA的提取
第十四章 真菌分子生物信息学常用软件的使用
1 概述
2 文件格式
3 FASTA格式
4 Tab(或其他分隔符)分隔的行文件
5 BLAST
6 Primer Premier 5
7 e-PCR
8 Clustal
9 BioEdit
10 Staden Package
参考文献