实用神经变性疾病生物学实验方法与技术

第一章　原代神经细胞培养和细胞功能测定　/ 1
第一节　原代皮质和海马神经元培养 1
第二节　新生小鼠中脑多巴胺能神经元培养 3
一、单层皮质星形胶质细胞表面培养新生鼠中脑多巴胺能神经元 3
二、单层星形胶质细胞表面培养新生鼠中脑多巴胺能神经元及形成
　　神经突触 9
三、本节实验中使用到的试剂和溶液 11
四、注意事项 13
五、常见问题及解决方案 13
六、预期结果 13
七、时间因素 14
第三节　小鼠神经干细胞培养 14
一、成年鼠神经干细胞培养 14
二、新生鼠海马神经干细胞的培养 19
三、胎鼠神经干细胞的培养 20
第四节　原代神经胶质细胞培养 21
一、星形胶质细胞的分离和培养 21
二、新生鼠小胶质细胞的原代培养 23
三、成年鼠小胶质细胞的分离和培养 25
第五节　小胶质细胞功能实验 29
一、趋化和迁移实验 29
二、体外测定小胶质细胞吞噬功能（吞噬尼罗红微球/a突触核蛋白/Ab） 30
第二章　模式动物行为学实验　/ 34
第一节　Morris水迷宫 34
第二节　Y-迷宫 36
第三节　小鼠平衡功能实验 39
第四节　抑郁模型的建立和评定 40
一、抑郁症的模型制作 41
二、抑郁动物的行为学评价 45
第五节　嗅觉行为功能测定 47
一、埋藏食物小球实验 48
二、嗅觉迷宫 48
第六节　大脑中动脉闭塞模型的建立和评定 49
第七节　运动功能评定 52
一、小鼠肢体力量测试实验——小鼠抓力测试 52
二、小鼠耐力测试实验——跑台实验 53
第八节　感觉（痛触觉）系统评估 54
一、Von Frey Test 54
二、智能热板仪 56
三、甩尾实验 57
第三章　神经病理学实验　/ 59
第一节　脑组织的取材、保存和标本制作 59
第二节　脊髓组织的取材、保存和标本制作 62
一、脊髓的取材和保存 62
二、 脊髓冰冻切片的制作 64
第三节　小鼠脑脊液采集 66
第四节　海马脑片场电位的神经电生理记录方法 67
第五节　神经免疫组织化学和免疫荧光染色 71
第六节　透视电镜标本制作 74
第七节　老化组织相关病理特殊染色（SA-b-gal 、银染色） 77
一、神经原纤维缠结（NFTs）染色 77
二、b-淀粉样蛋白染色 80
三、衰老相关b-半乳糖苷酶染色 82
第八节　 神经组织高尔基染色 83
第九节　神经组织体视学分析技术 86
第十节　共聚焦扫描及定量技术 92
一、激光共聚焦显微镜的成像原理 92
二、激光共聚焦显微镜在神经变性疾病研究中的运用 93
三、激光共聚焦显微镜结构 95
四、基本扫描及图像获取 95
五、微分干涉差（DIC）扫描及图像获取 102
六、拼图扫描及图像获取 103
七、Z-Stack扫描及图像获取 103
八、时间序列扫描 105
九、激光共聚焦图像定量及后处理 106
第四章　神经生化和基因检测　/ 115
第一节　转基因动物的基因型鉴定、保种和管理 115
一、小鼠生殖生理 115
二、小鼠的生长周期 116
三、基因工程鼠饲养繁殖一般流程和注意事项 116
四、常用小鼠品系的概况 117
五、几种常用神经变性疾病转基因鼠的介绍和鉴定 118
第二节　神经组织蛋白检测 125
一、蛋白质印迹法 125
二、免疫共沉淀原理及步骤 130
三、动物脑组织匀浆检测Ab 132
第三节　RNA提取及实时荧光定量PCR技术 134
一、RNA提取 134
二、RT-PCR 135
三、qPCR 135
第四节　基因芯片检测 140
一、单核苷酸多态性芯片实验 140
二、基因表达谱芯片检测 142
第五节　荧光素酶报告基因技术分析启动子转录活性 143
第六节　荧光定量PCR法检测端粒酶活性 146
第七节　中枢神经系统突触和非突触线粒体的分离提取 148
第五章　分子影像技术检测神经变性疾病　/ 157
第一节　PET/SPECT-CT显像探针的制备 158
第二节　fMRI成像技术的原理及其实验设计与数据处理 164
一、fMRI实验设计 164
二、实验设备 166
三、实验数据处理 166
四、fMRI实验相关的准备 169
五、小结 170
第六章　神经变性疾病患者临床神经评估、样本保存和数据库建设　/ 171
第一节　神经变性疾病临床登记和数据库建立和实施 171
一、临床研究目标的确立 171
二、研究方案的确立 172
三、组织机构的建立 173
四、病例报告表（CRF）的建立 174
第二节　神经变性疾病患者血液、脑脊液组织样本的保存和处理 177
一、血液及血液成分的处理和保存 178
二、脑脊液的处理和保存 179
三、标本DNA的提取和保存 180
　附表6-1　标本保存详细记录 180
　附表6-2　关于使用组织样本开展科学研究的知情同意书 181
第三节　 神经心理认知障碍测试诊断系统 182
一、医生端系统 182
二、用户管理 183
三、临床病例登记 183
四、案例管理 186
五、统计打印 190
六、量表管理 191
第七章　神经生物学常用分析及作图软件的应用　/ 193
第一节　Image J神经生物分析软件的应用 193
一、 Image J神经生物分析软件的基本功能 193
二、 Image J神经生物分析软件分析免疫荧光定量技术 197
第二节　Graphpad Prism 6.0作图和统计应用 205
一、折线图 205
二、直条图 208
三、生存曲线图 216
四、散点图 219
五、饼图 225
第三节　Logistic回归、Cox风险模型以及Kaplan-Meier曲线的统计应用 231
一、Logistic回归分析和ROC工作曲线的制订 231
二、 Cox回归分析 238
三、Kaplan-Meier曲线分析 242
第四节　EndNote×7的应用 245
一、文献管理 245
二、论文撰写 245