基因工程（第二版）

1基因工程概述/ 001
1.1基因工程的概念与基本流程/ 001
1.1.1基因工程的概念/ 001
1.1.2基因工程的基本流程/ 002
1.2基因工程的发展简史/ 003
1.2.1基因工程诞生的背景/ 003
1.2.2基因工程的诞生/ 004
1.2.3基因工程的发展/ 006
1.3基因工程的研究意义和应用/ 007
1.3.1基因工程在功能基因组学研究中的应用/ 007
1.3.2基因工程在工业领域的应用/ 008
1.3.3基因工程在农业领域的应用/ 009
1.3.4基因工程在医药领域的应用/ 011
本章小结/ 013
复习题/ 013

2基因工程工具酶/ 014
2.1限制性核酸内切酶/ 014
2.1.1限制性核酸内切酶的发现和种类/ 014
2.1.2限制性核酸内切酶的命名/ 016
2.1.3限制性核酸内切酶的特征/ 016
2.1.4限制性核酸内切酶的同尾酶/ 018
2.1.5影响限制性核酸内切酶酶切反应的因素/ 020
2.1.6限制性核酸内切酶酶切位点的引入与消失/ 022
2.2DNA连接酶/ 023
2.2.1DNA连接酶的作用/ 023
2.2.2不同末端的连接策略/ 025
2.2.3影响DNA连接反应的因素/ 027
2.3DNA聚合酶类/ 029
2.3.1大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ/ 029
2.3.2Klenow大片段酶/ 030
2.3.3耐热的DNA聚合酶Taq/ 030
2.3.4T4噬菌体DNA聚合酶/ 031
2.3.5逆转录酶/ 032
2.4碱性磷酸酶/ 033
2.4.1碱性磷酸酶防止载体自连/ 033
2.4.2获得5′末端磷酸基团标记的探针/ 036
2.5末端脱氧核苷酸转移酶/ 036
2.6其他工具酶/ 037
2.6.1Ⅱs型限制性核酸酶/ 038
2.6.2Cas核酸内切酶/ 039
2.6.3Dicer酶/ 039
2.6.4重组酶/ 040
本章小结/ 043
复习题/ 043

3基因工程载体/ 044
3.1克隆载体/ 044
3.1.1质粒载体/ 045
3.1.2噬菌体载体/ 053
3.1.3黏粒载体/ 057
3.1.4人工微小染色体/ 058
3.2表达载体/ 060
3.2.1原核表达载体/ 060
3.2.2真核表达载体/ 072
本章小结/ 076
复习题/ 076

4目的基因的获取与制备/ 077
4.1从基因文库获取目的基因/ 078
4.1.1基因组文库的构建与筛选/ 078
4.1.2cDNA基因文库的构建与筛选/ 083
4.2电子克隆法获取目的基因/ 092
4.2.1利用EST数据库进行电子克隆/ 093
4.2.2利用基因组数据库进行电子克隆/ 093
4.2.3全长cDNA 的判断/ 094
4.2.4电子克隆基因的生物信息学分析/ 095
4.3PCR 获取与扩增目的基因/ 095
4.3.1常规PCR/ 095
4.3.2反向PCR/ 102
4.3.3反转录PCR/ 104
4.3.4实时荧光定量PCR/ 105
4.3.5多重PCR/ 110
4.3.6巢式PCR/ 113
4.3.7不对称PCR/ 113
4.3.8RACEPCR/ 114
4.3.9原位PCR/ 114
4.4通过蛋白质工程改建目的基因/ 116
4.4.1蛋白质工程的概念/ 116
4.4.2蛋白质工程的定点突变技术/ 117
4.4.3蛋白质工程的定向进化技术/ 121
本章小结/ 123
复习题/ 124

5目的基因导入受体细胞的方法/125
5.1把目的基因导入大肠杆菌/ 126
5.1.1自然条件下的转化过程/ 126
5.1.2感受态受体细胞的选择/ 128
5.1.3外源目的基因转化进入大肠杆菌细胞的方法/ 129
5.1.4外源基因通过噬菌体转导进入受体细胞/ 131
5.2把目的基因导入酵母细胞/ 133
5.2.1聚乙二醇介导的酵母转化/ 133
5.2.2金属阳离子介导的酵母转化/ 134
5.3把目的基因导入植物细胞/ 134
5.3.1DNA直接转移法/ 135
5.3.2农杆菌Ti质粒载体介导法/ 137
5.4把目的基因导入动物细胞/ 141
5.4.1外源基因导入离体培养的动物细胞/ 142
5.4.2外源基因导入在体动物细胞/ 144
本章小结/ 147
复习题/ 147

6阳性转化子的鉴定/148
6.1遗传表型检测法/ 148
6.1.1利用载体提供的表型特征筛选和鉴定重组DNA分子/ 149
6.1.2利用外源目的基因本身的序列提供的表型特征筛选/ 153
6.2酶切电泳检测/ 155
6.2.1凝胶电泳检测筛选/ 155
6.2.2限制性核酸内切酶酶切分析筛选/ 156
6.3核酸分子杂交/ 158
6.3.1Southern印迹杂交/ 159
6.3.2Northern印迹杂交/ 164
6.3.3蛋白质印迹分析/ 167
6.4PCR扩增鉴定筛选/ 168
6.5DNA序列测定/ 169
6.5.1Sanger双脱氧末端终止法/ 169
6.5.2化学降解法/ 171
6.5.3自动测序法/ 172
6.5.4二代测序技术/ 173
6.5.5三代测序技术/ 176
6.5.6单细胞测序技术/ 179
6.5.7高通量测序在组学研究中的应用/ 180
本章小结/ 184
复习题/ 184

7基因工程在基因功能研究中的应用/185
7.1基因的表达谱研究技术/ 185
7.1.1胚胎原位杂交技术/ 186
7.1.2胚胎抗体染色技术/ 190
7.1.3基因芯片技术/ 194
7.2基因的突变研究技术/ 199
7.2.1化学诱变/ 199
7.2.2转座子全基因组诱变/ 200
7.3基因敲除技术/ 204
7.3.1完全基因敲除技术/ 204
7.3.2条件基因敲除技术/ 209
7.4基因编辑技术/ 214
7.4.1锌指核酶基因敲除技术/ 215
7.4.2TALEN基因编辑技术/ 218
7.4.3CRISPR基因编辑技术/ 221
7.5基因敲减技术/ 241
7.5.1RNA干扰技术/ 241
7.5.2Morpholino干扰技术/ 244
7.6基因过表达与异位表达技术/ 246
7.6.1GAL4/UAS系统的构建/ 247
7.6.2GAL4/UAS定时开启系统/ 248
7.7基因的相互作用研究技术/ 249
7.7.1凝胶迁移率阻滞技术/ 250
7.7.2染色质免疫沉淀技术/ 250
7.7.3酵母双杂交技术/ 253
7.7.4免疫共沉淀技术/ 256
本章小结/ 257
复习题/ 258

8转基因植物/259
8.1转基因植物研究和生产现状/ 260
8.1.1转基因植物的研究概况/ 260
8.1.2抗除草剂转基因作物/ 261
8.1.3抗虫转基因作物/ 263
8.1.4提高作物产量和品质的转基因作物/ 266
8.1.5其他转基因作物/ 268
8.1.6植物生物反应器/ 273
8.2转基因植物的筛选与检测/ 275
8.2.1报告基因/ 275
8.2.2分子生物学检测方法/ 277
8.3转基因植物的安全性/ 278
8.3.1转基因安全性的由来/ 279
8.3.2转基因安全性的争论/ 279
8.3.3转基因作物安全性评价程序/ 284
8.3.4转基因作物安全性的监管/ 285
本章小结/ 287
复习题/ 287

9转基因动物/288
9.1动物转基因技术/ 289
9.1.1显微注射法/ 289
9.1.2逆转录病毒感染法/ 294
9.1.3胚胎干细胞介导法/ 297
9.1.4体细胞核移植法/ 299
9.2转基因动物的筛选与检测/ 305
9.2.1报告基因/ 305
9.2.2分子生物学检测方法/ 306
9.2.3转基因动物整体表型的观察/ 309
9.3转基因动物的现状与应用/ 309
9.3.1转基因动物的现状/ 309
9.3.2转基因动物在基因功能研究中的应用/ 310
9.3.3转基因技术在动物育种中的应用/ 311
9.3.4转基因动物在医学研究中的应用/ 313
9.3.5动物生物反应器/ 314
本章小结/ 318
复习题/ 318

10基因治疗/319
10.1基因治疗的概念与策略/ 319
10.1.1基因治疗的途径与策略/ 320
10.1.2基因治疗的基本程序/ 321
10.1.3基因治疗的发展、现状与问题/ 323
10.2基因治疗的载体/ 328
10.2.1逆转录病毒载体/ 328
10.2.2腺病毒载体/ 329
10.2.3腺相关病毒载体/ 332
10.2.4单纯疱疹病毒载体/ 333
10.2.5非病毒载体/ 335
10.3重要疾病的基因治疗/ 336
10.3.1遗传病的基因治疗/ 336
10.3.2肿瘤的基因治疗/ 342
10.3.3艾滋病的基因治疗/ 358
本章小结/ 367
复习题/ 367

参考书目与文献/368