酶学方法：CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN 在创建特异性位点改变基因组中的应用

目录
第1章 Cas9的体外酶学 1
1.1 导论 1
1.2 Cas9表达和纯化 3
1.3 引导RNA的制备 6
1.4 内切核酸酶切割分析 10
1.5 结束语 13
致谢 14
参考文献 14
第2章 采用CRISPR/Cas核酸酶和缩短的引导RNA在人体细胞中靶向基因组编辑 18
2.1 导论 18
2.2 方法 30
利益冲突 39
参考文献 39
第3章 TALEN、Cas9和其他基因组编辑酶的特异性测定 42
3.1 导论 43
3.2 方法 56
3.3 结论 62
致谢 62
参考文献 63
第4章 定制重组酶基因组工程 69
4.1 导论 70
4.2 靶识别 71
4.3 重组酶构建 73
4.4 重组酶活性的测定 74
4.5 位点特异性整合 76
4.6 结论 78
致谢 78
参考文献 78
第5章 人细胞基因组工程 81
5.1 导论 82
5.2 人基因组结构 83
5.3 使用可编程核酸酶对人基因编辑的范围 85
5.4 可编程核酸酶用于人细胞基因组编辑 87
5.5 使用可编程核酸酶对人类遗传疾病的修复 89
5.6 使用可编程核酸酶对人非遗传疾病的治疗 90
5.7 人多能干细胞基因组工程 91
5.8 可编程核酸酶对人细胞的递送 92
5.9 切口酶修饰人基因组 94
5.10 基因编辑人细胞的富集 95
5.11 结论 95
致谢 96
参考文献 96
第6章 人细胞基因组编辑 103
6.1 导论 104
6.2 基因打靶策略 104
6.3 核酸酶靶位点的选择 105
6.4 实验规程 106
6.5 可供选择的方法 112
参考文献 115
第7章 活细胞荧光成像技术标记内源性基因位点及使用ZFN、TALEN和Cas9进行分子计算 119
7.1 导论 119
7.2 方法 121
7.3 标记/编辑局限性 133
7.4 远景 134
致谢 135
参考文献 136
第8章 Cas9切口酶基因组编辑 139
8.1 导论 139
8.2 靶选择 142
8.3 质粒sgRNA构建 142
8.4 细胞系sgRNA的验证 143
8.5 细胞收获与DNA提取 144
8.6 错配酶法SURVEYOR缺失分析 144
8.7 使用Cas9n HDR和非HDR插入 146
8.8 HDR和插入事件的分析 147
8.9 疑难问题解决 147
致谢 148
参考文献 148
第9章 DR-GFP报道基因和Cas9核酸酶分析哺乳动物细胞中断裂和切口诱导同源重组 150
9.1 导论 151
9.2 克隆切口酶和Cas9催化死亡变种 152
9.3 靶位点选择和sgRNA构建的克隆 155
9.4 细胞转染和流式细胞仪分析 157
9.5 材料 161
9.6 结论 161
参考文献 162
第10章 获得性CRISPR/Cas9功能基因组筛选 164
10.1 导论 164
10.2 高通量筛选载体设计的改良 165
10.3 sgRNA文库的构建 169
10.4 引导文库逆转录病毒的转导 174
10.5 关于筛选设计参数的注意事项 175
10.6 涉及sgRNA文库池阳性选择筛选“命中”解码 177
10.7 结论 178
参考文献 178
第11章 人多能干细胞基因组快速编辑的iCRISPR平台 181
11.1 导论 182
11.2 iCas9hPSC的产生 185
11.3 用iCRISPR产生敲除hPSC 194
11.4 用iCRISPR精确改变核苷酸的传代 202
11.5 用iCRISPR诱导hPSC基因敲除 204
11.6 结论和前景 206
致谢 208
参考文献 209
第12章 用Cas9DSB和nCas9配对切口产生人体细胞癌症易位 213
12.1 导论 214
12.2 材料 215
12.3 诱导和检测癌症在人细胞中易位方法 217
12.4 结论 228
致谢 229
参考文献 229
第13章 人类基因治疗的基因组编辑 232
13.1 导论 233
13.2 人原代CD4+T细胞B2M的基因组编辑 234
13.3 用CRISPR/Cas9对人CD34+CCR5中的CCR5打靶 243
参考文献 249
第14章 CRISPR/Cas9在大鼠基因组位点特异性突变的产生 252
14.1 原理 253
14.2 设备 255
14.3 材料 255
14.4 方案 257
14.5 第1步：sgRNA靶寡核苷酸体外转录 258
14.6 第2步：Cas9mRNA的体外转录 261
14.7 第3步：假孕雌性大鼠和单细胞大鼠胚胎的制备 263
14.8 第4步：单细胞胚胎显微注射和假孕大鼠胚胎移植 265
14.9 第5步：创建大鼠的鉴定 269
14.10 第6步：F1代大鼠的产生 273
参考文献 273
第15章 单质粒注射在小鼠中CRISPR/Cas9的基因组编辑 275
15.1 导论 276
15.2 pX330设计和CRISPR/Cas9质粒构建 278
15.3 pX330体外验证 281
15.4 环形质粒注射一步产生突变小鼠 284
15.5 打靶突变小鼠的筛选 285
15.6 结论 286
致谢 287
参考文献 288
第16章 CRISPR/Cas9在活细胞中基因组元件成像 290
16.1 导论 291
16.2 稳定表达dCas9-GFP细胞系的产生 294
16.3 使用慢病毒载体表达sgRNA 297
16.4 非重复序列的标记 298
16.5 CRISPR检测基因组座的成像 300
16.6 结论 302
致谢 302
参考文献 303
第17章 热带爪蟾中基于Cas9基因组编辑 305
17.1 导论 305
17.2 原理 306
17.3 方案 308
17.4 讨论 317
致谢 319
参考文献 319
第18章 斑马鱼中基于Cas9基因组编辑 322
18.1 导论 323
18.2 插入/缺失突变的靶向产生 328
18.3 靶向基因组编辑的其他策略 335
18.4 前景 340
致谢 341
参考文献 341
第19章 果蝇中基于Cas9基因组编辑 352
19.1 导论 352
19.2 基于CRISPR基因组编辑应用和设计考虑 353
19.3 CRISPR组分的递送 356
19.4 CRISPR试剂的配制 359
19.5 突变子的检测 363
致谢 369
参考文献 369
第20章 生殖细胞注射CRISPR/Cas RNA的无转基因基因组编辑 373
20.1 理论、哲学和实际问题 374
20.2 设备 377
20.3 材料 378
20.4 靶序列识别 378
20.5 产生sgRNA构造 379
20.6 sgRNA的体外合成 381
20.7 hCas9mRNA体外合成 382
20.8 sgRNA和mRNA的注射 384
20.9 CRISPR/Cas突变产生的恢复 384
参考文献 385
第21章 拟南芥和烟草中Cas9的基因组编辑 388
21.1 导论 388
21.2 Cas9和sgRNA的表达 390
21.3 双sgRNA引导基因组编辑 391
21.4 远景 394
21.5 注释 395
致谢 397
参考文献 397
第22章 工业酵母基因组CRISPRm多元工程 399
22.1 导论 400
22.2 质粒设计 402
22.3 Cas9表达 403
22.4 引导RNA表达 403
22.5 筛选方法 405
22.6 结束语 410
致谢 410
参考文献 411
第23章 Cas9增强功能蛋白质工程 413
23.1 导论 414
23.2 方法 419
23.3 结论 427
参考文献 427