典型微囊藻毒素微生物降解技术及原理

1 绪论
1．1 MCs的物化特性及其毒性
1．1．1 MCs的物化特性
1．1．2 MCs的毒性
1．2 MCs的提取提纯及分析测定
1．2．1 MCs的提取提纯研究进展
1．2．2 MCs的分析测定研究进展
1．3 MCs污染的控制
1．3．1 物理法
1．3．2 氧化降解法
1．3．3 生物降解法
2 研究内容及技术路线
2．1 研究目标
2．2 研究内容
2．2．1 菌种筛选及其生理生化特征研究
2．2．2 菌株的分子生物学鉴定
2．2．3 茵株降解MC-RR特性
2．2．4 基因USTB-05-A的克隆
2．2．5 基因USTB-05-A的表达
2．2．6 菌株降解MC-RR的第一步分子途径及机理
2．3 技术路线
3降解MC-RR菌株的筛选与生理生化特征
3．1 实验材料与仪器设备
3．1．1 蓝藻藻样
3．1．2 菌种来源
3．1．3 微生物培养基及培养条件
3．1．4 药品与试剂
3．1．5 主要仪器
3．2 实验方法
3．2．1 MC-RR的分析测定
3．2．2 MC-RR提取提纯
3．2．3 菌种筛选
3．2．4 菌株细胞形态观察
3．2．5 菌株生长曲线的绘制
3．2．6 菌株耐盐性研究
3．2．7 菌株耐酸碱性研究
3．2．8 茵株抗生素抗性研究
3．3 MC-RR的提取提纯结果
3．4 菌种筛选结果
3．4．1 混合茵种筛选
3．4．2 纯菌种筛选
3．5 菌落形态观察及革兰氏染色
3．6 USTB-05的生长曲线
3．7 菌株USTB-05的耐盐性
3．8 菌株USTB-05的耐酸碱性
3．9 USTB-05对抗生素的抗性
3．10 本章小结
4 菌株USTB-05的分子生物学鉴定
4．1 实验材料
4．1．1 菌株和质粒
4．1．2 培养基
4．1．3 PCR引物
4．1．4 药品与试剂
4．1．5 常用的生物信息分析的相关软件及网站．
4．1．6 主要仪器
4．2 实验方法
4．2．1 USTB-05基因组DNA的提取
4．2．2 PCR反应体系及步骤
4．2．3 琼脂糖凝胶电泳
4．2．4 目的基因的回收
4．2．5 目的基因与pGEM-T Easy载体连接
4．2．6 连接产物转化DH5a感受态细胞
4．2．7 质粒的提取
4．2．8 阳性克隆鉴定与测序
4．2．9 16S rDNA序列分析与茵属鉴定
4．3 USTB-05基因组DNA的提取结果
4．4 16S rDNA的PCR扩增结果
4．5 16S rDNA片段序列分析结果
4．5．1 去栽体
4．5．2 BLAST搜索
4．6 系统发育树的绘制
4．7 本章小结
5 USTB-05对MC-RR的降解特性研究
5．1 实验材料
5．1．1 菌种与试剂
5．1．2 主要仪器
5．2 实验方法
5．2．1 溶解氧对USTB-05降解MC-RR的效应．
5．2．2 温度对USTB-05降解MC-RR的影响
5．2．3 pH值对USTB-05降解MC-RR的影响
5．2．4 USTB-05菌株对MC-RR的降解-
5．2．5 USTB-05菌株无细胞提取液（CE）制备
5．2．6 CE对MC-RR的降解
5．3 溶解氧的效应
5．4 温度的影响结果
5．5 初始pH值的影响结果
5．6 不同培养条件下USTB-05的生长情况
5．7 USTB-05菌株对MC-RR的降解
5．8 无细胞提取液对MC-RR的降解
5．9 本章小结
6 基因USTB-OS-A的克隆
6．1 实验材料
6．1．1 菌种
6．1．2 药品及试剂
6．1．3 主要溶液
6．1．4 主要仪器
6．2 实验方法
6．2．1 PCR获取USTB-05降解基因簇片段
6．2．2 DNA凝胶电泳
6．2．3 目的片段回收
6．2．4 目的片段与T载体连接
6．2．5 连接产物转化DH5a感受态细胞
6．2．6 质粒提取
6．2．7 阳性克隆鉴定及测序
6．2．8 反向PCR获取USTB-05未知序列
6．2．9 高保真PCR获取USTB-05菌完整降解基因．
6．2．10 设计基因USTB-05-A克隆引物
6．2．11 PCR扩增、连接T载体、转化及鉴定
6．2．12 pGEX-4T-1载体获得
6．2．13 目的基因与pGEX-4T-1载体制备
6．2．14 重组质粒pGEX-USTB-05-A／BL21（DE3）构建
6．2．15 阳性克隆鉴定及测序
6．3 降解MC-RR基因初步探索
6．4 反向PCR扩增未知序列
6．4．1 反向PCR扩增结果
6．4．2 序列分析拼接
6．5 高保真PCR获取USTB-05菌降解MC-RR完整基因
6．5．1 高保真PCR
6．5．2 序列拼接
6．5．3 获取开放阅读框（ORF）
6．6 PCR扩增USTB-05-A基因
6．7 克隆重组质粒转化大肠杆菌的阳性鉴定
6．8 T Easy／USTB-05-A测序结果
6．9 USTB-05-A基因与pGEX-4T-1载体双酶切
6．10 表达重组质粒转化大肠杆菌的阳性鉴定
6．11 本章小结
7 基因USTB-05-A的表达
7．1 实验材料
7．1．1 菌种及主要药剂
7．1．2 主要溶液
7．1．3 主要仪器
7．2 实验方法
7．2．1 SDS-PAGE检测蛋白质表达
7．2．2 USTB-05-A基因工程茵总蛋白提取及浓度测定
7．2．3 影响诱导表达单因素条件试验
7．2．4 最佳条件下的重组蛋白诱导表达
7．2．5 重组蛋白酶包涵体鉴定
7．2．6 重组蛋白酶的分离纯化
7．2．7 表达蛋白酶的活性验证
7．2．8 基因工程茵与USTB-05茵体降解MC-RR活性对比
7．3 影响表达量的单因素影响结果
7．4 最佳条件下重组蛋白酶诱导表达
7．5 包涵体验证结果
7．6 表达蛋白降解MC-RR活性验证
7．7 重组蛋白酶初步分离
7．8 USTB-05菌体与基因工程菌降解MC-RR活性对比
7．9 本章小结
8 USTB-05催化降解MC-RR第一步机理
8．1 实验材料
8．1．1 主要溶液
8．1．2 主要仪器
8．2 实验方法
8．2．1 重组蛋白酶对MC-RR的降解
8．2．2 MC-RR第一个降解产物质谱分析
8．3 重组蛋白酶对MC-RR的降解结果
8．4 MC-RR第一个降解产物质谱分析
8．5 USTB-05降解MC-RR第一步途径推测
8．6 本章小结
9 结论与展望
9．1 主要结论
9．2 主要创新点
9．3 展望
参考文献
附录 USTB-05-A基因与mlrA基因序列