轮状病毒VP7基因植物表达技术研究

第1 章　轮状病毒研究概况　1
1.1 轮状病毒的危害 3
1.2 轮状病毒的基本特性 4
1.3 轮状病毒蛋白特征 5
1.4 轮状病毒的血清学分类 8
1.5 轮状病毒疫苗的发展概况 9
1.6 轮状病毒疫苗的效果和有效性 15

第2 章　植物生物反应器生产药用蛋白研究进展及霍乱毒素B 亚基（CTB） 与连接肽介绍　17
2.1 植物生物反应器生产药用蛋白概况 19
2.2 植物生产药用蛋白的优势和面临的挑战 24
2.3 植物生产药用蛋白的技术平台 27
2.4 植物生产疫苗 31
2.5 霍乱毒素 B 亚基（CTB）与连接肽 39

第3 章　轮状病毒外壳蛋白VP7 在原核中表达的研究　43
3.1 原核表达材料和仪器设备 45
3.2 HRVVP7 基因序列合成及克隆载体构建 51
3.3 构建 pET-22b-HRVVP7 原核表达载体 55
3.4 HRVVP7 原核表达条件优化及表达产物的存在形式 61
3.5 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 64
3.6 HRVVP7 纯化 65
3.7 免疫印迹法检测 66
3.8 基因序列合成及克隆载体构建结果 67
3.9 pET-22b-HRVVP7 原核表达载体构建结果 72
3.10 HRVVP7 原核表达条件优化及表达产物的存在形式结果 73
3.11 HRVVP7 纯化结果 75
3.12 蛋白免疫印迹检测结果 77

第4 章　拟南芥表达轮状病毒外壳蛋白VP7 的研究　83
4.1 拟南芥表达实验材料及仪器准备 86
4.2 构建pPhaP3301-HRVVP7-linker-CTB 和pPhaP3301-HRVVP7 植物表达载体 90
4.3 转化拟南芥与筛选 97
4.4 转化拟南芥的分子生物学检测 101
4.5 HRVVP7-linker-CTB 核酸序列合成及优化结果 103
4.6 PCR 扩增 HRVVP7 核酸序列结果 105
4.7 pEASY -T1-HRVVP7 载体构建结果 107
4.8 构建pPhaP3301-HRVVP7-linker-CTB 和pPhaP3301-HRVVP7 植物表达载体结果 107
4.9 农杆菌的转化及鉴定 110
4.10 拟南芥阳性植株的筛选 111
4.11 转基因拟南芥在转录水平上的表达分析 113
4.12 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果 114
4.13 蛋白免疫印迹检测结果 115
4.14 酶联免疫吸附剂测定分析外源蛋白的表达量 116

第5 章　红花种子表达轮状病毒外壳蛋白VP7 的研究　123
5.1 红花表达实验材料及试剂准备 125
5.2 pPhaP3301-HRVVP7 质粒冻融法转化农杆菌 127
5.3 红花的遗传转化 127
5.4 抗性苗嫁接 128
5.5 转基因植株的基因组 PCR 鉴定 129
5.6 BCA 法测定红花种子中总蛋白浓度 130
5.7 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测红花种子中 HRVVP7 蛋白的表达 131
5.8 蛋白免疫印迹检测红花种子中 HRVVP7蛋白的表达 131
5.9 酶联免疫吸附剂测定检测红花种子中HRVVP7 蛋白的表达水平 132
5.10 转基因红花苗的获得 132
5.11 转基因红花叶片 PCR 检测结果 133
5.12 BCA 测定总蛋白 134
5.13 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测种子蛋白表达结果 135
5.14 蛋白免疫印迹检测种子蛋白表达结果 136
5.15 酶联免疫吸附剂测定检测种子蛋白表达水平 137

第6 章　转基因拟南芥种子的免疫学检测　141
6.1 免疫检测实验材料及仪器准备 143
6.2 转基因拟南芥植株总蛋白量测定 145
6.3 动物免疫 146
6.4 小鼠产生 HRVVP7 抗体效价测定 146
6.5 抗体中和实验 148
6.6 乳鼠攻毒实验 149
6.7 数据统计与分析 150
6.8 转基因拟南芥种子总蛋白提取与蛋白含量测定 151
6.9 小鼠免疫后产生 HRVVP7 抗体效价测定 153
6.10 HRVVP7 抗体中和病毒效果分析 158
6.11 乳鼠攻毒后观察统计 160

参考文献　169

附录　轮状病毒相关知识简介　183