手性β-氨基醇生物催化合成实验技术

章　手性β-氨基醇概述 1
1.1　手性β-氨基醇简介 2
1.2　手性β-氨基醇的应用 2
1.3　手性β-氨基醇的合成 3
1.3.1　化学法合成手性β-氨基醇 3
1.3.2　生物法合成手性β-氨基醇 9
参考文献 19

第二章　β-氨基醇特异性转氨酶高通量筛选方法的建立 26
2.1　引言 27
2.2　实验材料与仪器 27
2.2.1　菌株来源 27
2.2.2　实验试剂 28
2.2.3　实验仪器 28
2.3　实验方法 28
2.3.1　显色反应条件探究 28
2.3.2　筛选方法灵敏度探究 29
2.3.3　转氨酶的筛选 30
2.3.4　分析方法 30
2.4　结果与分析 30
2.4.1　显色条件 30
2.4.2　筛选方法的灵敏度 33
2.4.3　全细胞空白对照 34
2.4.4　转氨酶的筛选 34
2.5　小结 35
参考文献 35

第三章　恶臭假单胞菌ω-转氨酶基因的克隆及其在手性β-氨基醇合成中的应用 36
3.1　恶臭假单胞菌中ω-转氨酶基因的克隆与重组表达 37
3.1.1　引言 37
3.1.2　实验材料与仪器 37
3.1.3　实验方法 39
3.1.4　结果与分析 42
3.1.5　小结 47
3.2　恶臭假单胞菌ω-转氨酶酶学性质表征及其底物特异性研究 48
3.2.1　引言 48
3.2.2　实验材料 48
3.2.3　实验方法 49
3.2.4　结果与分析 52
3.2.5　小结 58
参考文献 59

第四章　结核分枝杆菌转氨酶(MVTA)的克隆及其在手性β-氨基醇合成中的应用 60
4.1　引言 61
4.2　实验材料与仪器 61
4.2.1　菌株与质粒 61
4.2.2　试剂盒 61
4.2.3　实验试剂 61
4.2.4　实验仪器 62
4.2.5　培养基及其他试剂配制 63
4.3　实验方法 64
4.3.1　引物设计及目的基因的PCR扩增 64
4.3.2　转氨酶MVTA表达载体的构建及目的蛋白质的表达与纯化 65
4.3.3　酶活力测定方法 67
4.3.4　转氨酶MVTA酶活力的适反应pH及pH稳定性 68
4.3.5　转氨酶MVTA酶活力的适反应温度及温度稳定性 68
4.3.6　转氨酶MVTA动力学参数和对映选择性测定 68
4.3.7　转氨酶MVTA不对称胺化α-羟基酮氨基供体的筛选 69
4.3.8　转氨酶MVTA不对称胺化α-羟基酮 70
4.3.9　不同浓度二甲基亚砜对反应的影响 70
4.3.10　不同浓度R-苯乙胺对反应的影响 70
4.3.11　产物L-苯甘氨醇对反应的影响 71
4.3.12　产物苯乙酮对反应的影响 71
4.3.13　反应过程中底物浓度、反应时间和细胞用量对反应的影响 71
4.3.14　制备S构型苯甘氨醇 71
4.3.15　分析方法 71
4.4　结果与分析 72
4.4.1　重组载体的构建 72
4.4.2　MVTA目的蛋白质的表达及纯化 73
4.4.3　转氨酶的适pH 73
4.4.4　转氨酶pH稳定性 74
4.4.5　转氨酶的适温度 74
4.4.6　转氨酶温度稳定性 75
4.4.7　MVTA动力学参数和对映选择性测定 76
4.4.8　MVTA动力学拆分外消旋β-氨基醇 77
4.4.9　不对称胺化α-羟基酮氨基供体的选择 78
4.4.10　pH对不对称还原胺化反应的影响 78
4.4.11　温度对不对称还原胺化反应的影响 78
4.4.12　助溶剂二甲基亚砜（DMSO）浓度对不对称还原胺化反应的影响 79
4.4.13　底物浓度和产物浓度对不对称还原胺化反应的影响 80
4.4.14　细胞用量对不对称还原胺化反应的影响 80
4.4.15　MVTA不对称胺化α-羟基酮 81
4.4.16　制备S-苯甘氨醇 82
4.5　小结 83
参考文献 84

第五章　巨大芽孢杆菌转氨酶BMTA的克隆及其在手性邻氨基醇合成中的应用 85
5.1　引言 86
5.2　实验部分 87
5.2.1　材料与试剂 87
5.2.2　实验方法 87
5.2.3　分析方法 90
5.3　结果与讨论 90
5.3.1　ω-转氨酶BMTA的表达、纯化和酶活检测 90
5.3.2　pH对ω-转氨酶BMTA活性及稳定性的影响 91
5.3.3　温度对ω-转氨酶BMTA活性及稳定性的影响 91
5.3.4　ω-转氨酶BMTA的底物特异性 92
5.3.5　ω-转氨酶BMTA动力学拆分外消旋?-氨基醇 93
5.3.6　ω-转氨酶BMTA不对称还原胺化羟酮 93
5.3.7　ω-转氨酶BMTA动力学拆分外消旋苯甘氨醇制备（S）-苯甘氨醇 94
5.4　小结 94
参考文献 94

第六章　羰基还原酶组合转氨酶级联催化外消旋β-氨基醇同时制备手性β-氨基醇和手性邻二醇 95
6.1　羰基还原酶的克隆与表达 96
6.1.1　引言 96
6.1.2　实验材料与仪器 96
6.1.3　分析方法 98
6.1.4　实验方法 99
6.1.5　实验结果 103
6.1.6　小结 107
6.2  羰基还原酶酶学性质表征 107
6.2.1　引言 107
6.2.2　实验材料与仪器 108
6.2.3　分析方法 108
6.2.4　实验方法 109
6.2.5　实验结果 110
6.2.6　小结 115
6.3  羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶在E.coli中共表达及不对称还原?-羟酮 116
6.3.1　引言 116
6.3.2　实验材料与仪器 117
6.3.3　分析方法 117
6.3.4　实验方法 118
6.3.5　实验结果与分析 121
6.3.6  小结 128
6.4　级联生物催化外消旋β-氨基醇同时制备手性β-氨基醇和邻二醇 129
6.4.1　引言 129
6.4.2　实验材料与仪器 129
6.4.3　实验方法 130
6.4.4　分析方法 132
6.4.5　结果与分析 132
6.4.6　小结 139
参考文献 140

第七章　环氨基醇特异性脱氨酶产生菌的筛选及其应用于手性环氨基醇的合成 141
7.1　高活力高选择性环氨基醇脱氨酶产生菌的筛选 142
7.1.1　引言 142
7.1.2　实验材料与仪器 142
7.1.3　实验方法 144
7.1.4　结果与分析 148
7.1.5　小结 154
7.2　节杆菌环己胺氧化酶的克隆及其酶学性质表征 155
7.2.1　引言 155
7.2.2　实验材料与仪器 155
7.2.3　实验方法 157
7.2.4　结果与分析 162
7.2.5　小结 170
参考文献 171

第八章　生物催化环氧化物不对称开环制备手性β-氨基醇 172
8.1　醇脱氢酶的筛选 173
8.1.1　引言 173
8.1.2　实验材料 174
8.1.3　实验方法 177
8.1.4　实验结果分析 180
8.1.5  小结 182
8.2　立体选择性级联生物催化外消旋二醇合成手性β-氨基醇 183
8.2.1　引言 183
8.2.2　实验材料 183
8.2.3　实验方法 185
8.2.4　实验结果 187
8.2.5　小结 191
8.3　三酶共表达重组菌的构建及催化苯乙二醇合成手性β-氨基醇 191
8.3.1　引言 191
8.3.2　实验材料 191
8.3.3　实验方法 192
8.3.4　实验结果 195
8.3.5　小结 198
8.4　多酶级联催化环氧化物不对称开环合成手性β-氨基醇 198
8.4.1　引言 198
8.4.2　实验材料 199
8.4.3　实验方法 200
8.4.4　实验结果 212
8.4.5　小结 222
参考文献 223

第九章　级联生物催化烯烃不对称胺羟化合成手性β-氨基醇的研究 224
9.1　引言 225
9.2　实验材料 225
9.2.1　实验药品 225
9.2.2　培养基 226
9.2.3　实验仪器 226
9.3　实验方法 227
9.3.1　重组大肠杆菌的构建 227
9.3.2　重组大肠杆菌的诱导表达 228
9.3.3　目的蛋白质的酶活力检测 228
9.3.4　冻干酶粉的制备 229
9.3.5  多酶级联体系催化烯烃1a不对称胺羟化合成手性β-氨基醇5a的条件优化 229
9.3.6  多酶级联体系催化烯烃1a～j不对称胺羟化合成手性β-氨基醇5a～j 230
9.3.7　共表达体系的构建 231
9.3.8　两种重组大肠杆菌细胞催化烯烃不对称胺羟化合成手性β-氨基醇 235
9.3.9　共表达细胞催化烯烃不对称胺羟化合成手性β-氨基醇 236
9.3.10  E.coli（CGS-DEM）和E.coli（CGS-DEB）制备手性β-氨基醇 237
9.3.11　气相色谱分析法 237
9.4　结果与讨论 239
9.4.1　重组大肠杆菌的构建 239
9.4.2  多酶级联催化烯烃1a不对称胺羟化合成手性β-氨基醇5a的条件优化 240
9.4.3  多酶级联催化烯烃1a～j不对称胺羟化合成手性β-氨基醇5a～j 242
9.4.4　共表达体系的构建 243
9.4.5　两种重组大肠杆菌细胞催化烯烃不对称胺羟化合成手性β-氨基醇 245
9.4.6　共表达细胞催化烯烃不对称胺羟化合成手性β-氨基醇 247
9.4.7  E.coli（CGS-DEM）和E.coli（CGS-DEB）制备手性β-氨基醇 249
9.5　小结 249
参考文献 250