基孔肯雅病毒理论与实验技术指南

目录
第一部分　临床和诊断病毒学　
第一章　基孔肯雅病毒进化和流行病学　3　
1.1　引言　3　
1.2　病毒的传播循环和媒介　3　
1.3　病毒的历史和起源　4　
1.4　2004年以来基孔肯雅病毒的流行病学和感染传播情况　5　
1.5　基孔肯雅病毒在西半球的感染情况　6　
1.6　结语　7　
参考文献　7　
第二章　基孔肯雅病毒分子流行病学　10　
2.1　引言　10　
2.2　材料　12　
2.2.1　病毒RNA的提取　12　
2.2.2　一步法反转录-聚合酶链反应（One-step RT-PCR）　12　
2.2.3　聚合酶链反应（PCR）产物的琼脂糖凝胶电泳和纯化　13　
2.2.4　测序反应　13　
2.2.5　PCR测序产物的纯化　13　
2.3 方法　14　
2.3.1　病毒RNA的提取　14　
2.3.2　一步法RT-PCR　14　
2.3.3　琼脂糖凝胶电泳和纯化PCR产物　14　
2.3.4　测序反应　15　
2.3.5　纯化循环测序产物　15　
2.3.6　测序数据编辑　16　
2.3.7　系统发育树的构建　16　
2.4　注释　16
参考文献　17
第三章　高级遗传方法学在基孔肯雅病毒进化和传播追踪溯源研究中的应用　19　
3.1　引言　19　
3.2　材料　20　
3.3　方法　20　
3.3.1　序列生成　21　
3.3.2　从公共数据库获得序列　21　
3.3.3　多序列比对　21　
3.3.4　序列多态性和基因突变分析　22　
3.3.5　中值连接进化网络的构建　23　
3.3.6　生成一个时间尺度的贝叶斯系统发育树，并通过BEAST软件包计算目标序列到最近的共同祖先的时间（tMRCA）以确定祖先的年代　24　
3.3.7　BEAST跟踪输出的可视化　26　
3.3.8　用BEAST系统发育树输出方式构建最大分支可信度树　27　
3.3.9　一致最大分支可信度树的可视化　27　
3.3.10　通过BEAST2软件进行系统地理学分析来确定病毒株时空传播特点　27　
3.3.11　用SPREAD软件使系统地理学输出可视化　29　
3.4　注释　29
参考文献　32
第四章　基于合成肽的抗体检测方法诊断有无神经系统并发症的基孔肯雅病毒感染　34　
4.1　引言　34　
4.2　材料　35　
4.2.1　单向电泳　35　
4.2.2　双向电泳　36　
4.2.3　电洗脱　37　
4.2.4　液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析　37　
4.2.5　多肽合成　37　
4.2.6　酶联免疫吸附试验（ELISA）　38　
4.3　方法　38　
4.3.1　单向电泳　38　
4.3.2　双向电泳　39　
4.3.3　电洗脱　41　
4.3.4　蛋白液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析　41　
4.3.5　多肽合成41　
4.3.6　酶联免疫吸附试验（ELISA）　42　
4.4　注释　43
参考文献　44
第五章　E2糖蛋白在Sf9昆虫细胞的表达和纯化及其在血清学中的应用　45　
5.1　引言　45　
5.2　材料　46　
5.2.1　昆虫表达组件的构建　47　
5.2.2　Sf9细胞的维持及E2糖蛋白的瞬时表达　47　
5.2.3　在昆虫细胞中稳定表达E2糖蛋白　47　
5.2.4　稳定表达细胞的冻存　48　
5.2.5　自然分泌CHIKV-E2的纯化　48　
5.2.6　基孔肯雅病毒的血清学诊断　48　
5.3　方法　48　
5.3.1　构建昆虫表达组件　48　
5.3.2　Sf9细胞的维持和E2糖蛋白的瞬时表达　49　
5.3.3　E2糖蛋白在昆虫细胞中的稳定表达　50　
5.3.4　稳定细胞的低温保存　51　
5.3.5　纯化自然分泌的CHIKV-E2蛋白　51　
5.3.6　CHIKV的血清学诊断　52　
5.4　注释　53
参考文献　54
第六章　基于血清学工具的CHIKV感染诊断方法　55　
6.1　引言　55　
6.2　材料　60　
6.3　方法　61　
6.3.1　血清样品的准备　61　
6.3.2　血清和病毒混合液的准备　62　
6.3.3　细胞培养　62　
6.3.4　用中和过的病毒感染细胞　62　
6.3.5　计算结果　62　
6.4　注释　62
参考文献　63
第七章　使用咽拭子及尿液标本诊断基孔肯雅病毒感染及其评价　65　
7.1　引言　65　
7.2　材料　66　
7.2.1　病毒检测　66　
7.2.2　ELISA检测IgM抗体　66　
7.2.3　体外病毒分离　67　
7.2.4　体内病毒分离　67　
7.3　方法　67　
7.3.1　通过分子生物学技术和测序分析检测病毒基因组　67　
7.3.2　IgM抗体捕获-ELISA血清学检测　68　
7.3.3　体外病毒分离　69　
7.3.4　体内病毒分离　70　
7.4　注释　70
参考文献　71
第二部分　细胞培养、病毒复制和细胞反应　
第八章　用蚊子细胞扩增基孔肯雅病毒　75　
8.1　引言　75　
8.2　材料　76　
8.2.1　培养C6/36细胞　76　
8.2.2　病毒扩增　76　
8.3　方法　76　
8.3.1　培养C6/36细胞　76　
8.3.2　病毒扩增　77　
8.4　注释　78　
参考文献　79
第九章　基孔肯雅病毒感染的定量分析——病毒蚀斑试验　81　
9.1　引言　81　
9.2　材料　82　
9.3　方法　83　
9.3.1　收集用于蚀斑试验的样本　83　
9.3.2　接种BHK-21细胞于24孔板　84　
9.3.3　蚀斑试验　84　
9.4　注释　86
参考文献　88
第十章　实时RT-PCR检测与定量分析基孔肯雅病毒　90　
10.1　引言　90　
10.2　材料　91　
10.2.1　寡核苷酸序列　91　
10.2.2　病毒RNA提取　91　
10.2.3　常规RT-PCR　91　
10.2.4　PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及纯化　92　
10.2.5　体外转录合成cDNA　92　
10.2.6　一步法SYBR Green I实时RT-PCR　92　
10.2.7　一步法TaqMan实时RT-PCR　92　
10.3　方法　92　
10.3.1　病毒RNA提取　93　
10.3.2　体外转录PCR产物的制备　93　
10.3.3　琼脂糖凝胶电泳及PCR产物纯化　93　
10.3.4　体外转录　94　
10.3.5　RNA转录物的纯化　94　
10.3.6　总RNA产量的计算　94　
10.3.7　体外转录RNA拷贝数测定　95　
10.3.8　用于RNA绝对定量的标准品构建　95　
10.3.9　基于SYBR-Green I的实时RT-PCR的绝对定量　95　
10.3.10　基于TaqMan的实时RT-PCR的绝对定量　97　
10.3.11　定量未知样本中CHIKV载量　97　
10.4　注释　98
参考文献　100　
第十一章　伊蚊的基孔肯雅病毒感染　102　
11.1　引言　102　
11.2　材料　103　
11.2.1　含CHIKV的血液（CHIKV血饲）　103　
11.2.2　蚊子感染　103　
11.2.3　从蚊子收集CHIKV　104　
11.2.4　处理采集的蚊子脏器　104　
11.3　方法　104　
11.3.1　准备含病毒的血食物　104　
11.3.2　蚊子感染　105　
11.3.3　采集和处理受感染蚊虫的脏器　106　
11.3.4　处理采集的蚊虫组织器官　108　
11.4　注释　108　
参考文献　109　
第十二章　人工血食物感染蚊虫中CHIKV的分析　111　
12.1　引言　111　
12.2　材料　112　
12.2.1　蚊子的饲养　112　
12.2.2　制备含感染性CHIKV的血食物　113　
12.2.3　感染后蚊子的处理　113　
12.2.4　核酸的检测与定量　114　
12.3　方法　115　
12.3.1　埃及伊蚊和白纹伊蚊群落的饲养　115　
12.3.2　蚊子感染性血饲流程　116　
12.3.3　暴露后蚊子处理：通过分析CPE检测蚊子中的病毒　117　
12.3.4　暴露后蚊子处理：强迫唾液分泌　118　
12.3.5　CHIKV核酸检测与定量　119　
12.4　注释　119
参考文献　121　
第十三章　基孔肯雅病毒生长与荧光标记：免疫荧光法检测基孔肯雅病毒　122　
13.1　引言　122　
13.2　材料　123　
13.2.1　病毒生长　123　
13.2.2　荧光显微镜　123　
13.2.3　使用IFA进行血清学诊断　124　
13.2.4　流式细胞术　124　
13.3　方法　125　
13.3.1　细胞生长　125　
13.3.2　荧光显微镜下确定病毒的生长　125　
13.3.3　应用IFA进行血清学诊断　126　
13.3.4　流式细胞术测定病毒生长　127　
13.4　注释　127　
参考文献　128　
第十四章　用蔗糖密度梯度分离和制备基孔肯雅病毒样本用于透射电镜观察　130　
14.1　引言　130　
14.2　材料　131　
14.2.1　CHIKV的分离与扩增　131　
14.2.2　病毒纯化　131　
14.2.3　负染色和免疫金标记法　132　
14.3　方法　132　
14.3.1　分离CHIKV　132　
14.3.2　CHIKV滴定　133　
14.3.3　大规模扩增CHIKV用于病毒纯化　134　
14.3.4　聚乙二醇（PEG沉淀）纯化病毒　134　
14.3.5　不连续的蔗糖梯度纯化病毒　135　
14.3.6　负染法　136　
14.3.7　免疫胶体金标记　136　
14.4　注释　137　
参考文献　138　
第十五章　酵母双杂交筛选法研究病毒-宿主蛋白的相互作用　139　
15.1　引言　139　
15.2　材料　141　
15.2.1　GAL4 Y2H系统中使用的酵母菌株和质粒　141　
15.2.2　培养基　141　
15.2.3　酵母转化　142　
15.2.4　准备酵母蛋白提取物　143　
15.2.5　BD病毒融合构建物自激活的检测　144　
15.2.6　病毒-宿主相互作用文库的筛选　144　
15.2.7　酵母菌落PCR　144　
15.2.8　多重库质粒的排除　145　
15.2.9　限制性消化排除重复文库质粒　145　
15.