“下克上”这种事情，做多了，是会上瘾的。永禄八年（1565），松永久秀联手三好三人众进行了又一次的“下克上”，这一次，堪称是战国时代最火暴的一次“下克上”行动，因为松永久秀直接模仿“嘉吉之乱”中的赤松满祐，把“下克上”的矛尖对准了高高在上的幕府大将军足利义辉，而且采取的是公开的杀人放火行为。
　　
　　足利义辉不是泛泛之辈，他一生中致力于恢复室町幕府的荣光。因此，他不但本人学习了著名剑术家原卜和上泉信纲的剑法，成为一名赫赫有名的剑豪将军，而且在外交上也主动出击，介入了武田信玄与长尾景虎、毛利元就和尼子晴久等一对对大名之间的争执中，积极充当调停人的角色。另外，他还接受了织田信长、上杉谦信和大友宗麟的觐见，信长甚至允诺帮助他恢复幕府的尊严。
　　
　　这样一个不听话的将军自然不对松永久秀这样一个野心家的胃口。他需要的是一个能被他玩弄于股掌之上，能对他俯首听命的傀儡将军，足利义辉明显并不符合这一条件。在这一点上，松永久秀和三好三人众的看法是一致的，于是他们一拍即合，决定换掉这个不听话的将军。他们挑好了代替足利义辉的人：义辉的从弟足利义荣，此人足够听话，很适合充当他们被利用的工具。另一方面，足利义辉所仰赖的南近江六角家由于遭到浅井家的背叛和织田信长的进攻，自顾不暇，这也给了松永久秀等人很好的机会。
　　
　　永禄八年（1565）五月十九日，松永久秀联合三好三人众，带着军队明火执仗地包围了将军的驻地二条御所，公然向幕府将军的权威挑战。一群人冲进了足利义辉的居城，足利义辉对此也有准备，他从容不迫地提起秘藏的宝刀迎敌，凭借着自己剑豪的出色能力，杀伤多人，在短时间确实逼退了前来进攻的叛乱者。然而，双拳难敌四手，松永久秀的军队越来越多，从四面包围了二条御所，足利义辉在砍杀多人后也受伤多处，被长枪刺死，临终前留下了一句悲壮的辞世诗：“五月之雨，譬如朝露，又如泪水，我之名字，扶摇直上，而达云霄。”将军的母亲庆寿院也在这次叛乱中殉死。
　　
　　“永禄之变”震惊天下，松永久秀因此而背负上了弑主的恶名，足利义辉之弟觉庆在奈良的兴福寺出家，听说消息以后，就在细川藤孝等人的帮助下逃脱，前往投靠南近江的和田惟政，继而辗转越前，最后在织田信长的帮助下宣布自己是合法的幕府将军。此人便是后来的室町幕府末代将军足利义昭。
　　
　　足利义辉死后，在永禄之变中合作愉快的松永久秀和三好三人众很快反目。事实上，松永与三好三人众之间的关系一直处于恶劣的状态，在永禄之变中，他们不过是心照不宣的互相利用，狼狈为奸的关系。在合作完了以后，双方为争夺利益，自然会陷入分裂。永禄八年（1565）十一月，永禄之变后不到半年，三好三人众就突然袭击了松永一方的饭盛山城，身为三好家的继承人的三好义继此时却只好逃到高屋城避难。这次袭击拉开了新一轮京畿大战的序幕。三好三人众的同盟、大和的国人众筒井顺庆配合三人众发动攻势。在松永平定大和国的期间，筒井顺庆作为大和国人众的领袖，一直遭到打压，流亡在外。永禄九年（1566）四月，三好三人众和筒井顺庆联军攻打多闻山城，狡猾的松永久秀眼见不敌，就搬出了的商人津田宗达作为调停人。三好三人众眼看已占优势，于是就接受了调停的建议。
　　
　　不过这次的停火不过是一个短暂的插曲。永禄九年（1566）六月，筒井顺庆夺回了被松永占据的居城筒井城，局势向着更利于三人众的方向发展。同月，三好三人众举行了三好家的家督继承仪式，拥立三好义继为家督，并操纵三好义继发动了对松永久秀的讨伐。
　　
　　永禄十年（1567），三好义继因为与三人众的不和而逃奔信贵山城投奔松永久秀，双方的战争陷入了白热化状态。三好义继的逃亡激怒了三好三人众，他们联合筒井顺庆再次出兵多闻山城，十月，三好三人众与筒井联军在奈良东大寺布阵。东大寺为一座华严宗的佛教寺院，始建于奈良时代，其金堂因为供奉着一座卢舍那佛而被称为大佛殿。十月十日子夜时分，松永久秀与三好义继出兵奇袭东大寺的三好筒井联军，夜袭中，东大寺的大佛殿被兵燹所及，起了火灾，到丑时，东大寺大佛殿回廊已经化为一片废墟。当然，也有材料认为，这是松永久秀在夜袭中悍然放火，烧毁了东大寺，以松永久秀无法无天的一贯性格来看，这样的行为不是不可能的。