除了天文学发现之外，伽利略也推翻了亚里士多德对运动的许多观点，这些观点塑造了人们对真实世界的看法将近2000年。亚里士多德断言重物会比轻物掉落得更快，而日后的哲学家也相信这种说法。伽利略率先进行真实的实验——抛下及滚动不同重量的物体——结果与亚里士多德的理论不符，而这也替运动与重力的科学研究奠定了基础。不过他简洁的思想实验，早就对亚里士多德对落体的描述提出质疑：根据亚里士多德的说法，1千克重的物体与10千克重的物体会以不同的速度掉落。伽利略问，如果把它们绑在一起，它们掉落的速度会多快呢？根据亚里士多德的说法，较轻的物体会拖累较重的物体，因此一起掉落的速度会较慢。然而绑在一起会形成11千克的重量，应该会掉得更快。亚里士多德的理论发生自相矛盾，因此不可能是正确的。伽利略写道：“对于亚里士多德的错误观点，还需要更多的证明吗？”

伽利略热切地钻研阿基米德的研究。阿基米德以数学方法来处理杠杆原理、平面与立体物体的重心，以及浮体，在受到这样的启发后，伽利略深信科学必须建构在测量与数学的基础之上。阿基米德在研究水中物体的浮力上已有伟大的进展，伽利略了解空气也是流体，应该也赋予物体浮力。他认为这就是他所观察到的、较重与较轻物体的掉落速度有些微小差异的原因。在他生命即将结束之际，他宣称一块铅与一团羊毛在真空中会以相同的速度掉落。如果能看到阿波罗15号的宇航员史考特（David R. Scott）于1971年8月2日在无空气的月球表面所示范的证明，他肯定会感到欣慰。那天史考特同时抛下一根羽毛和一把槌子，让地球上的电视观众亲眼看到了这两个物体同时掉落在月球表面上。

只要互相竞争的天文理论能被视为虚构的数学小说，而且是为了让日历保持秩序、协助占星与导航，教堂就愿意保持不介入争论的超然态度。但是伽利略的观察，仔细绘制的木星卫星群、金星的盈缺，以及太阳表面的黑子，都把这一议题带入真实世界。更糟的是，伽利略坚持要以意大利文而非拉丁文著作，并且还向民众大力传播他的激进观念。这不再只是数学。地球要是不静止，就是会运行。地球与其上的人类要不是如教堂判定的，位于世界的中心，就是在太空中漫游，地位就不甚重要了。

虽然教宗保禄五世所领导的教会在刚开始时容忍伽利略及其新发现，但这样的宽容很快就消失了。罗马的宗教裁判所于1616年2月宣判地动说为异端邪说，并将哥白尼的《天体运行论》列为禁书，直到内容“修正”为止。这项禁令并未直接提及伽利略，但教宗派出著名的耶稣会神学家枢机主教贝拉明（Cardinal Roberto Bellarmino），亲自警告伽利略要停止宣传或捍卫哥白尼的观念。于是在后来的7年，伽利略仅将哥白尼系统当成假设来讨论。不过他的敌人，那些因他的发现、成功与奋战风格而感受到威胁的神学家与哲学家，则持续向宗教裁判所散布他的谣言。

1623年，巴尔贝里尼（Maffeo Barberini）成为新教皇乌尔班八世（Urban VIII）。伽利略与巴尔贝里尼熟识，视他为盟友，因此前往罗马与他对谈，后来就在这位教皇的同意下，他得以比较哥白尼与托勒密的系统，并写出结果。伽利略趁这个机会写下他广受欢迎且极具影响力的《关于托勒密和哥白尼两大世界体系的对话》。这本书首见于1632年，内容是三个角色在四“天”中进行的辩论，这三个角色分别是拥护哥白尼的萨维拉提（Salviati）、具有常识的萨格列多（Sagredo）以及亚里士多德学派的辛普利西奥（Simplicio）。

结果伽利略却惊慌地发现，一度是他的朋友，而且支持他的教皇转而反对他。历史学家至今仍在争论原因。乌尔班八世可能是因为在梵蒂冈内部的阴谋及横扫欧洲的宗教战争，而感到特别脆弱。长期不信任伽利略的耶稣会士也日益强大。此外，伽利略通过书中明显的输家辛普利西奥这个角色，说出了乌尔班教皇曾说过的一句话，“容易犯错的人类可能无法了解上帝的旨意”，可能令教皇觉得个人受到冒犯。无论理由为何，教皇下令展开调查。一个月不到，他的谋士就建议将伽利略以违反稍早的教皇警告加以审判。宗教裁判所命令伽利略前往罗马。这场审判费时四个多月，最后可怕的宗教裁判所把他的《 关于托勒密和哥白尼两大世界体系的对话 》列入禁书清单，并且判决伽利略因涉嫌宣传异端而“罪大恶极”。

伽利略与教会不平等的对抗以他下跪认罪告终。1633年6月22日星期三，他承认：

我以一颗诚挚的心和真实的信念，公开放弃、诅咒与憎恨曾前述之错误与异端邪说……我发誓在未来不再以口头或书面发表或宣称任何可能对我造成类似嫌疑之内容。

同一年的年底，异端裁判所允许伽利略返回他位于佛罗伦萨的宅邸。他显然已身心俱疲，并在多封信中描述自己有严重心悸与食欲不佳的情形。他在沮丧的情绪下，渴望能与深爱的女儿玛丽亚（Maria Celeste）团聚。她是位修女，1634年春天过世。到了1638年1月，具有伟大远见的伽利略已经眼盲。他写信给一位朋友表示：“我把先前所认可的天空、地球与宇宙界限放大了一百倍，不，一千倍，但现在对我而言，它们已缩小成由我个人占满的狭隘空间。”

伽利略于1642年1月8日逝世，但是他以大胆开阔的心灵，不休不眠的观察与实验，对所有物理现象均能以力学解释且以数学为科学之自然语言的坚持，以及积极奋战的勇气，为未来的科学家指引出了一条清晰的道路。