弗莱明很显然不知道法国人、比利时人的这些研究，但是此前英国人的研究他似乎不太可能一无所知。要知道，弗莱明养葡萄球菌并不是养着玩的，而是想要发现抗菌药物，应该会广为阅读与抗菌药物有关的文献。在意外降临之前，他为此已研究了7年，虽然他当初的目标是溶菌酶，但在发现了青霉的抗菌作用后，他立即想到可以从中开发出抗菌药物。他分离出能抗菌的青霉提取液，把它命名为青霉素，并发现它能抑制多种细菌的生长。1929年弗莱明在《英国实验病理学杂志》上报道了其发现。

但是弗莱明很快就不看好青霉素做为药物的用途。他发现青霉素很难成批生产，更难被纯化，如果口服的话不能被人体吸收，注射的话，只过几个小时就从尿液排泄出去了，还来不及在体内发挥抗菌作用呢。这些都表明青霉素不会是个实用的药物。在20世纪30年代，弗莱明虽然继续在实验室生产青霉素和向其他实验室推广青霉素，但是主要是从细菌学研究的角度，把它做为帮助研发疫苗的工具来用的（由于青霉素只是抑制某些种类的细菌的生长，就可以用它来帮助分离、纯化不受其影响的其他种类的细菌）。虽然弗莱明继续关注抗菌药物的开发，但是1934年起他停止了青霉素的研究，转向德国人新发现的磺胺药物了。

青霉素做为一种药物，最终是由牛津大学的霍华德·弗洛里（Howard Walter Florey）实验室开发出来的。1938年，犹太人恩斯特·钱恩（Ernst Boris Chain）逃离纳粹德国到了英国，在弗洛里实验室工作，其课题是研究天然抗菌物质，他读到了弗莱明1929年的论文，立即很感兴趣。他设法提取出了一些相对比较纯的青霉素，想用它在老鼠身上试一试。但是钱恩是个生物化学家，没有资格做动物试验，几次向弗洛里提出试验要求，弗洛里都很冷淡。后来，钱恩趁弗洛里不在，找一个同事帮忙，给两只被细菌感染的老鼠注射了青霉素。两只老鼠都康复。弗洛里获悉实验结果后，才对青霉素发生了兴趣。在他的领导下，组织了一支强大的研发队伍，生产出更多、更稳定的青霉素，开始了人体试验，并在美国进行大规模的生产。生产出来的青霉素首先被用于拯救盟军受伤战士，避免因受伤感染导致的死亡，据估计救了12％～15％战士的生命。战争结束后，青霉素即转为民用。

1945年，弗莱明、弗洛里、钱恩三人分享诺贝尔医学奖。但是一般人都只知道弗莱明发现了青霉素，不知道青霉素能从实验室走向临床，变成救人无数的良药，主要得归功于钱恩和弗洛里。而一些对青霉素的发现史有更多了解的人，则反过来贬低弗莱明的发现，认为他不过是重新发现了以前已有多人发现的现象而已，甚至有的人认为他不该得诺贝尔奖。然而，在弗莱明之前虽然有多人注意到了青霉能抑制细菌的生长，但是他们没有一个人像弗莱明那样做进一步的更深入的研究，更没有一个人像弗莱明那样确定了这个特殊的现象是由于青霉分泌的某种物质所致。所以，弗莱明虽然不是青霉抗菌现象的发现者，但是做为青霉素的发现者却是当之无愧的。