第一次远征希腊就遭受重创，波斯人很不甘心。之后，他们在短短两年里就又再次重整旗鼓，不但修造了不少战舰，而且还重新集结了大军，一切都蓄势待发。在远征大军出发之前，大流士一世先是向希腊派遣了使者，向各城邦要表示臣服的"水"、"土"，其目的就是试探到底哪些希腊人是要跟他抗争到底，哪些是会慑于他的威势俯首称臣。果如大流士一世所预料的那样，很多势力单薄的希腊城邦因害怕波斯帝国，纷纷献出"水"、"土"表示愿意臣服，而以雅典和斯巴达为首的一些势力强大的城邦，其反抗的意志则非常坚定。雅典将波斯使者从高山上抛入了万丈深渊，斯巴达则将使者扔到了井里，意为让波斯"自取水土"。

雅典和斯巴达此举让大流士一世大为恼怒，于是，波斯帝国第二次对希腊的远征于公元前490年开始。波斯大军的统帅是达提斯，他率领600 艘三列桨战舰，从希腊臣服的城邦萨摩司出发，跨爱琴海直奔希腊。出发之前，达提斯已经拟好了作战计划：攻克雅典、孤立斯巴达，进而征服全希腊。开始的时候波斯大军兵分两路，一路在利于骑兵行动、地势平缓的马拉松登陆，目的是诱使雅典军北上；另一路大军则是志在摧毁优卑亚岛西岸的城市，此举是为了威慑敌手。最后的目的当然是雅典城。

波斯大军要在马拉松平原登陆，此举对雅典大为不利。当敌军兵临城下，雅典马上向斯巴达求援，同时还派出了以米太雅得为首的主战派迎战。不料，斯巴达统治者根本不想出兵相助雅典，便借口"现在不行，只有等月亮圆了，才能出兵相助"拒绝之。雅典知道一切只有靠自己了。开始时，由于雅典方面出现了战和不定的心态，而波斯方面的军队也尚未就位，故双方无声无息地对峙了8 天。到了第 9 日，因波斯大军在另一路战线有所突破，很可能从海上直趋雅典城。面对此情形，雅典深知马拉松一战宜速战速决，以便回师守城。

第10日破晓时分，雅典军发动进攻。在雅典的一番排兵布阵之下，雅典由作战伊始的敌方的中路军队不敌而退，到后来的两翼军队对波斯军队形成三面夹攻的围势，到最后的波斯军队大败溃逃。雅典军一鼓作气，乘胜追杀至海边，波斯军队急忙登船逃走，但最后还是有7只战舰被雅典俘获。波斯军队兵败马拉松，而从海上进攻雅典城的战机也丧失，早前设想的作战计划已被彻底破坏，只得悻悻退兵回国。

马拉松一役结束，但希波战争并未结束。雅典一个个小小城邦，居然打败了一个强大的波斯帝国，而这也是希腊人第一次靠自己的力量击败波斯。一边是希腊人欢欣鼓舞，一边则是大流士一世怒不可遏。大流士一世不允许自己帝国的权威被挑衅，他准备再战。于是，他下令一切城市装备军队，提供远比以前更多的船只、马匹、粮饷和运输船，战前的准备工作让波斯人整整忙了三年时间。