1800年大选是美国历史上最激烈而隆重的选举之一，两党之争达到空前的高潮。联邦党人攻击共和党人具有雅各宾主义和恐怖主义倾向，而杰斐逊的支持者则指责对方政治专横，剥夺了人民的民主权利，甚至指责他们的目的是恢复贵族政治。最终杰斐逊大获全胜。在近代史上，反对党第一次从执政党手中程序性地接管了国家政权，杰斐逊成了美国历史上第一位在大选中击败执政党当选总统的在野党领袖。联邦党从此逐渐走进了历史，随之而来的是“弗吉尼亚王朝”的延续和共和党人长达二十多年的政治统治。

总统 1801年3月4日中午，杰斐逊拒绝卫队的护送和像其前任那样佩带宝剑，与几位朋友一同步行来到会场，发表了一个旨在清除隔阂，加强合作的就职演说。这个就职仪式是简短朴实的，充分体现了平民精神和亲民原则，为许多后继者所仿效。

杰斐逊希望建立一个民主、理性和有限权威的政府，一上任就着手革除积弊，以开创一个体现“1800年革命”精神的崭新局面。他一贯倡导民主和自治，防止专制暴政，主张严格解释宪法，限制政府权力。他精简军队，裁撤冗员，促使政府采取措施，开源节流，减轻民众负担，废除了曾触发威士忌酒暴动的联邦酒税。他还废除了上届政府颁布的一些为民众所厌恶的法令，同时致力于消弥党派分歧。

在总统的日常工作中，杰斐逊保持了廉洁和亲民的朴实作风，废除了许多繁文缛节和等级差别。他开创了白宫向公众开放的先例，举办宴会时使用圆桌，以取消席位等级，还取消外事活动中的繁琐礼仪。但有一次，他因穿着睡衣接见英国使节而受到嘲笑和指责。

在任免问题上，杰斐逊在理论上主张政府向德才兼备的人开放，但在实际操作中采取了务实的态度，免除了那些政治观点保守而又缺乏工作能力的人的职务，同时把一批忠于共和主义原则并有能力的人充实进政府各部门。其中，国务卿詹姆斯·麦迪逊和财政部长艾伯特·加勒廷是其最重要的内阁成员，他们既是杰斐逊最得力的助手，又是总统忠实的政治追随者和好朋友。但他坚决反对结党营私，以免政府机构成了少数人的专属领地和以权谋私的工具。

杰斐逊召回了大部分驻外使节，为国家节省了大量资金和宝贵的人力。这也说明，杰斐逊在外交领域奉行孤立主义原则，以尽可能避免参与欧洲事务。

入主白宫后，杰斐逊继承发扬了他在蒙蒂赛洛的好客精神，经常设宴款待各方宾朋。来客中有内阁成员、国会议员、科学家、探险家、艺术家、外国使节和友人等，也有联邦党人和政治上的反对派。他创造了一种“民主的”进餐制度，即客人们可以随意就座。杰斐逊这样做的目的在于：为各方面创造一个机会，加强相互沟通和了解，以消弥隔阂和偏见，创造一种和谐融洽的政治氛围，同时也可以使他多了解一些外界的信息，听一听不同的意见和声音。