1922年8月，中共中央在杭州西湖召开特别会议，决定同国民党进行两党合作。国共合作成为中国共产党的头等大事。

1923年6月，毛泽东出席在广州召开的中共三大。三大的中心议题是讨论国共合作问题。会上，张国焘提出：工人阶级应该在“自己政党旗帜下”进行革命，“若加入了资产阶级性的国民党组织，便不免有混乱无产阶级思想的危险”。张国焘反对共产党员加入国民党，也反对在工人、农民中发展国民党组织。毛泽东针对张国焘的发言，依据自己领导安源路矿、长沙泥木工人罢工中注意团结各方人士的经验，论证工人加入统一战线的必要性，赢得多数代表的支持。大会接受共产国际于同年1月12日通过的在中国实行国共合作的决议，通过《关于国民运动及国民党问题的决议案》，决定同国民党合作，建立各民主阶级的革命统一战线。

在中共三大上，毛泽东被选为中央执行委员和由五人组成的中央局成员。随后，又被推为秘书，协助委员长陈独秀处理日常事务，起草、联署文件（按规定，中央发出的文件必须由委员长和中央局秘书联名签发），掌管党的组织工作。中共三大期间，毛泽东捎信给当时任中共湘区委员会负责人的李维汉，指示他注意在安源产业工人中发展国民党组织。湘区委接受他的建议，委派何叔衡、刘少奇与国民党元老覃振等组织筹备组。

中共三大后，毛泽东驻上海中央局机关。为促进第一次国共合作尽快实现，他经常通宵达旦地审阅和起草各种党内文稿，同时还在党的机关刊物《向导》周报上不断发表文章，号召建立全国各阶层的联合战线，同心协力地进行反帝反军阀的国民革命。他在《北京政变与商人》一文中强调指出：“中国现在的政治问题，不是别的问题，就是简单的一个国民革命问题。用国民的力量来打倒军阀并打倒和军阀狼狈为奸的外国帝国主义，这是中国国民的历史使命”。为完成这个神圣的历史使命，他呼吁全国各阶层人民团结起来，建立一个“严密的联合战线”，“用革命的方法，开展一个新时代，创造一个新国家”!

为贯彻中共三大关于国共合作的决议，毛泽东于1923年9月又专程回到湖南，指导中共湘区区委筹组国民党湖南地方组织。9月28日，他致信当时的国民党党务部部长彭素民、副部长林伯渠，谈在湖南发展国民党工作。他说：“关于本党在湘发展，虽在军事时代仍应努力进行，昨与夏希同志(夏希极能做事，在学生界有力量)商议分三步办法：第一步组织长沙支部；第二步组织常德衡州及其它可能的分支部；第三步再组织湖南总支部。关于长沙支部，现决定即日租定房子成立筹备机关(秘密的)，多邀信仰三民主义及有活动能力的人入党，然后开成立会推出候补支部长，呈请本部委任”。在毛泽东的推动下，10月初，国民党长沙支部成立。次年4月，组织了湖南省临时省党部。1925年10月，正式建立国民党湖南省党部。

1923年冬，毛泽东受命离开湖南，赴广州参与筹备中国国民党第一次全国代表大会。在共产国际和中国共产党的帮助下，孙中山于1924年1月20日到30日在广州主持召开国民党“一大”，确立了联俄、联共、扶助农工的政策。毛泽东出席大会还就《组织国民政府之必要》、《出版及宣传问题》、《本党设立研究会》、《比例选举制》等议案作了发言，阐述自己的立场和观点，推动大会在国共合作问题上朝着正确的方向发展。30日，毛泽东被大会选为国民党候补中央执行委员。

国民党“一大”的召开，标志着第一次国共合作的正式建立。以此为契机，揭开了轰轰烈烈的大革命高潮。

国民党“一大”结束的次日，毛泽东参加了由孙中山主持召开的国民党一届一中全会。会议决定派遣中央执行委员分别在上海、北京、汉口、哈尔滨、四川五处组织执行部，以中央直属机构的名义全权领导各地区的党务。会后，毛泽东以候补中央执行委员的身份参加上海、北京、汉口、哈尔滨、四川五处组织执行部，以中央直属机构的名义全权领导各地区的党务。会后，毛泽东以候补中央执行委员的身份参加上海执行部的实际领导工作，以主要精力从事统一战线的工作。2月25日，上海执行部第一次执行委员会会议议决由毛泽东代理秘书科主任职务和组织部秘书职务。毛泽东在担任这两个职务期间，按照国民党“一大”的要求，主持组织部负责对国民党员的重新登记工作。毛泽东在上海执行部一直工作到1924年12月，他团结国民党左派，对国民党右派破坏国共合作的行径进行坚决的斗争。如1924年8月1日，在叶楚伧的策划下，一些国民党右派在上海南方大学召开代表会议，讨论所谓“处置共产分子问题”。当即激起左派的反对，还造成武斗。后来，右派分子又闯入上海执行部，殴打邵力子。事件发生后，毛泽东、恽代英等14人联名上书孙中山，控告叶楚伧“主持不力，迹近纵容”的破坏国共合作罪行。此后，毛泽东和叶楚伧的斗争公开化，毛泽东多次及时揭露叶的分裂行径，叶也因此嫉恨毛泽东。由于叶楚伧的排挤、打击、独断专行，也由于在国共合作策略上毛泽东与陈独秀的观点有分歧，再加上他工作劳累，身体虚弱，失眠严重，毛泽东于1924年12月底请假回湖南“养病”。毛泽东借回乡“养病”之机领导发动了韶山等地的农民运动。

1925年9月上旬，毛泽东从湖南到达广州。10月5日，国民党中央党部党务会议决定由毛泽东代行国民党中央宣传部长职务。稍后，他又着手创办《政治周报》，并担任主编。