1926年元旦，国民党“二大”在广州召开，毛泽东作为湖南代表出席，并再次当选为国民党中央候补执行委员。在会上，毛泽东和其他共产党人一起，团结国民党左派，积极进行反对“西山会议派”的斗争。1月8日，毛泽东代表国民党中央宣传部作《宣传报告》。他在结束语部分讲道：“两年来在革命宣传与反革命宣传相对抗之中，革命宣传确是取一种攻势……反革命宣传却始终是一种守势。为了招架不住，才抬出‘反共产’、‘赤色帝国主义’这两块挡箭牌来。这种对抗攻守的现象，乃中国革命势力日益团结进取，而反革命势力日益动摇崩溃的结果”。在毛泽东等中国共产党人和国民党左派的共同努力下，中国国民党第二次全国代表大会通过了《处分违犯本党纪律党员决议案》、《弹劾西山会议决议案》等，决定永远开除邹鲁、谢持的党籍，对居正、石青阳、叶楚伧等十二人提出警告，责其改正，命令叶楚伧将上海《民国日报》交出改组，责令戴季陶限期反省。大会给“西山会议派”以沉重的打击。

蒋介石是国共合作中后期统一战线内出现的新右派的代表。1926年3月，蒋介石制造了反共的“中山舰事件”。这是蒋介石向共产党和国民党左派发起进攻的信号。事件发生后，毛泽东极力主张给予以蒋介石为代表的新右派以坚决回击。茅盾(沈雁冰)回忆说：“中山舰事变的第二天晚上，毛主席同我谈起大局形势，记得主席说了大体是以下的一些话：蒋介石现在掌握的实力唯第一军，而第一军的下级军官和士兵大部分是有觉悟的，就省城而言，蒋的实力是大的，但就全局而言，蒋的实力是小的。他此番制造中山舰事件，向我们突然进攻，一是威胁，二是试探。我方示弱，他就要得寸进尺；我方强硬，他就要知难而退。故我方万万不能示弱妥协，要坚持同他斗争。”毛泽东还极力主张“把我们当时掌握的武装力量集中在粤、桂边境某地(我忘其名)，同时说服国民党左派撤出广州，争取第一军外各军(他们同蒋本来有矛盾)反蒋，至少使他们中立，名正言顺地声讨蒋背叛统一战线，破坏国共合作，以武力对武力，逼蒋下台，削弱他的兵权。”毛泽东还进一步分析了当时各派政治力量及第一军以外各军的情况，他指出：“假若我方退让，则他们会由于蒋的利诱和威胁而倒向蒋。”毛泽东积极将上述意见和主张向苏联军事顾问团代理团长季山嘉和中共两广区委书记陈延年提出建议。但是，季山嘉坚决反对。陈延年犹豫不决，说“不敢作主”，要“请示上海中央”才能决定。最后，毛泽东的正确主张没有被以陈独秀为首的党中央所接受，相反采取了退让妥协的政策，从而使蒋介石首先顺利地控制了国民革命军第一军和黄埔军校的领导权。“中山舰事件”后，从黄埔军校和第一军退出的共产党员达250多人，毛泽东和周恩来建议把这批共产党员派到其他军中去，建立叶挺独立团式的革命军队，但陈独秀又拒绝了这一正确主张，因此这个计划未能完全实行。

1926年5月，蒋介石又在国民党二届二中全会上，提出所谓《整理党务案》，规定共产党在国民党中央及省、市党部任执行委员的人数不得超过全体委员会的三分之一，共产党员不得担任国民党中央的部长等等。这是蒋介石企图限制和削弱中国共产党在统一战线中的领导地位，阴谋篡夺国民党党权的又一个严重反革命步骤。中共中央派张国焘、彭述之去指导出席这次会议的中共党团，在党团会议上讨论《整理党务案》时，大家意见很不一致。最后，张国焘按照他同陈独秀商定的让步方针，要大家签字接受。毛泽东拒绝签字，主张“坚决顶住”，同时，在国民党二届二中全会表决《整理党务案》时，他也没有举手。但是，由于陈独秀等的退让方针，《整理党务案》还是被通过。担任国民党中央部长的共产党员被迫全部辞职。毛泽东也离开了国民党中央宣传部。

随着北伐战争的胜利进行，蒋介石欲篡夺党、政、军大权，建立独裁统治的面目更加暴露无遗。1927年1月，中共和国民党右派在武汉地区开展了以反对蒋介石军事独裁为中心内容的“提高党权运动”，而党权运动的最高峰是3月中旬在武汉召开的国民党二届三中全会。毛泽东出席了这次会议，主张坚决反对以蒋介石为首的右派势力。鉴于蒋介石和国民党中央执行委员会主席张静江曾于1月3日在南昌召集中央政治会议临时会议，擅自决议中央党部和国民政府暂住南昌，挑起“迁都之争”的事实，为防止当时仍留在南昌的蒋介石、张静江故伎重演，毛泽东在7日的预备会上提议：“在大会期间，政治会议停止开会，如有重大事故发生，应付与主席团全权办理”。这一提议得到于树德的赞同。表决时，多数通过。毛泽东在会上还主张取消蒋介石操纵的黄埔同学会，亦获全体通过。在共产党人和国民党左派的共同努力下，全会通过了多项限制蒋介石权力的决议。

蒋介石制造“赣州惨案”之后，3月15日，毛泽东主持的中央农民运动讲习所举行阳新、赣州死难烈士追悼会。毛泽东在会上发表演说，指出：“在这革命的范围内，竟不断演出惨杀农工的事实，由此可证明封建的残余势力，正准备着秣马厉兵，向我们作最后的挣扎啊!从今日起，我们要下一决心，向那些反动分子势力进攻，务期达到真正目的。”在共产党人和国民党左派的领导下，武汉地区掀起一个规模巨大的反蒋运动，这是武汉政府时期反对国民党右派的高峰。