1925年1月，中共第四次代表大会在上海举行。陈独秀被选为中央局总书记兼组织部主任。10月，陈独秀出席了在北京召开的中央委员会扩大会议。

1927年4月27日，中央第五次代表大会在武汉召开。陈独秀被选为党的总书记。在会上，陈独秀的长子陈延年、次子陈乔年同时被选为中央委员。陈延年同时被选为政治局候补委员。

1927年大革命失败后，陈延年、陈乔年相继被国民党杀害。陈延年和陈乔年于1922年6月至1923年先后赴法国勤工俭学和赴莫斯科东方大学学习。陈延年曾先后任中共广东区委组织部长、区委书记，中共江浙区委书记，江苏省委书记，1927年6月29日牺牲时，年仅29岁。陈乔年先后任中共北京地委组织部长、北方区委组织部长，中共湖北省委书记，中共中央组织部副部长，中共江苏省委组织部长等职。1928年1月19日牺牲时，年仅26岁。大半年时间内，陈独秀痛失两个爱子，身心受到巨大摧残。

陈独秀曾经对濮清泉（濮德治）说：第五次代表大会，自己成为众矢之的，大家骂我是“右倾”机会主义、投降主义，我投降了哪个？蒋介石把延年、乔年都杀了，我投降他吗？汪精卫高唱：“革命的到左边来，不革命的滚开去。”不仅我以为他是“左派”，连斯大林也认为他是“左派”。

1929年11月5日，陈独秀被开除党籍。在这期间，陈独秀逐渐接受了苏联托洛茨基的观点，对共产国际的独裁专制颇为不满，办刊物、写文章声明中国的问题应该由中国人自己研究解决。

陈独秀虽被开除党籍，但他并未放弃信仰和追求，并且坚决反对南京国民党政府的黑暗统治。

1932年10月，在上海家中，国民党以“危害民国罪”为名将陈独秀逮捕入狱。

陈独秀是被费克勤出卖被捕的。上海市长吴铁城获悉后立即电告南京政府，蒋介石电示称陈独秀系危害民国罪，应交法院审判，将其押解南京军事法庭审判。

1933年4月14日，江苏省高等法院开始公开审理陈独秀的案件，指控他“危害民国”。陈独秀大声抗辩：“我只承认反对国民党和国民政府，却不承认危害民国，因为政府并非国家……孙中山、黄兴等曾推翻满清政府，打倒北洋政府，如谓打倒政府就是危害国家，那么国民党岂非已叛国两次？”旁听席上传出一阵哄笑。