胡格诺派教徒要求凯瑟琳·德·美第奇，作为太后，制止吉斯兄弟以她年轻儿子的名义，对他们展开的迫害。凯瑟琳开始运用她的权力了，但是，1560年，弗兰西斯二世去世，由他十岁的弟弟继位，成为查理九世。如果凯瑟琳的大儿子已经表现得很令人失望，那么她的二儿子甚至更糟；来自他父亲的遗传基因，和凯瑟琳的父亲、患梅毒的洛伦佐、乌尔比诺公爵的遗传基因的结合，已经显示出不吉利的征兆。像他的哥哥一样，查理九世身体相当虚弱，除此之外，他还遭受精神不定的痛苦。

这次，凯瑟琳决定采取措施，并确信她会被任命为摄政王；她的目的是不惜任何代价维护和平。新教现在已经有一些合法权利，但是，实际上，正在国家迅速蔓延的越来越不利的氛围中，这些权利大部分被忽视。凯瑟琳能制定法律，但无权实施法律，1562年，国内爆发内战。一年后，吉斯公爵弗兰西斯，在奥尔良围攻新教徒时被一名间谍击中；当审讯间谍时，他承认他是受雇于新教领袖阿德米拉尔·德·科利尼。

1563年，内战结束时，查理九世在鲁昂最高法院宣布到了法定统治年龄，接下来，凯瑟琳陪同年轻的国王对法国进行了长达两年的巡视，因此，她能够把自己展示给人民，并获得他们的忠心。但是，吉斯党派和他们激进的天主教支持者们，专注于在1567年和1568年再次发动的内战。凯瑟琳尽全力促使和解；她与吉斯党派进行谈判，甚至邀请新教领袖阿德米拉尔·德·科利尼会见国王。当科利尼抵达巴黎，凯瑟琳恰巧不在，去照看她生病的女儿克劳德洛林公爵夫人。科利尼在缺乏经验的且易受感动的年轻查理九世身上，运用他的全部魅力，他们在卢浮宫的王室里进行彻夜长谈。显然，科利尼试图破坏凯瑟琳对国王的支配，当这话被凯瑟琳获悉，她气愤地返回巴黎，很快重申她的权力高于意志薄弱的查理九世。

最后，试图使两派之间达成和解，凯瑟琳安排她的女儿玛格丽特与年轻的波旁王室血统的新教领袖、纳瓦拉的亨利结婚；1572年8月，天主教和新教的领袖聚集巴黎，见证这个婚礼。不顾民众的庆祝表示，巴黎圣母院和教堂塔楼发出的钟声，在城市上空回荡，街上的气氛变得不安起来，巴黎正处在夏季酷暑阶段，热得人喘不过气来。教皇明显表明他反对这个婚姻，声称，天主教和新教之间不会联合；典礼不能在巴黎圣母院举行，立刻转到外面的广场举行。正当这时候，新教领袖炫耀地“上前一步”站在典礼台前面，给新婚夫妇主持了弥撒。

四天后，8月20日，星期三，庆祝达到高潮时，有人想暗杀科利尼。在他正走在德－贝蒂西街（现在的德－里沃利街）上时，一颗火绳枪的子弹从楼上的一扇窗子射下来，不过刚好，科利尼正弯下腰系鞋带，所以只是受了伤。后来发现开枪的那间房子是属于吉斯家族的一个家臣的。很明显，他们是为弗兰西斯·吉斯公爵的暗算寻求报复。

凯瑟琳和查理九世赶紧来到科利尼床旁，科利尼要求与国王单独谈谈。在返回卢浮宫的路上，凯瑟琳声色俱厉地威逼查理九世，迫使他透露在他们密谈时科利尼都说了些什么——很明显，科利尼告诫年轻的国王不要依赖凯瑟琳。此时，巴黎正处在混乱当中：两百名胡格诺教徒占领了坐落在德－贝蒂西街的住宅，一群武装的胡格诺教徒在街上搜寻。市场关闭、商店关门、市民躲在家里。

此时，需要迅速采取行动，否则，首都的形势将失去控制，极有可能在国内爆发另外一场内战。第二天，查理九世证实科利尼事实上正在图谋害他，由于背叛了新朋友，据说他已经变得精神错乱。这是查理九世的独自行为，还是他母亲的怂恿，不得而知，但是，8月24日，星期日一大早，圣巴多罗马日，一个吉斯派成员率领一群瑞士王室守卫队，突然拦住科利尼，并把他刺死，把他的尸体从窗户扔到街道下面。这是王室军队受巴黎天主教指使屠杀胡格诺教徒的信号。胡格诺教徒——男人、女人和孩子——被从他们的床上拖到城市各处，并被杀害，大屠杀持续了两天，两天中，两千五百人被杀。当圣巴多罗马日大屠杀的消息传遍法国，同样的屠杀也发生在奥尔良、鲁昂、里昂、波尔多和图卢兹；总共，多达八千人丧命。这标志着一系列宗教战争的开始，接下来的三十年，法国遭受着宗教战争之苦。

很有可能，凯瑟琳·德·美第奇，至少要为圣巴多罗马日大屠杀负部分责任。是由于恐慌，还是把这视为唯一的途径，不得而知；尽管让人可能有点儿怀疑，如果她不首先打击，那么她和国王的生命，将受到极大的威胁。无论哪一方面，凯瑟琳·德·美第奇都将因这次血债——法国历史上最无耻的行为而受谴责。从此以后，她将被视为法国天主教对抗胡格诺新教的领袖。