主张政教分离，是新教的一个特色，新教在本质上都是主张政教分离的，因为这是它基本教义所导致的必然结论。路德阐述了政教分离的教理和《圣经》依据之后，众多的新教教派在“因信成义”的教义基础之上以及对天主教的政教合一的传统的反省基础之上，主张政教分离。

路德之后在德国兴起的敬虔主义（Pietism）运动，是对以后的新教造成很大影响的宗教运动，现在北美的大多数新教教派都很大程度地受了敬虔主义的影响。比如在北美具有众多教友的圣公会、长老会、浸道会、卫理宗等等，都吸收了敬虔主义的教义，一些大的教会支派直接就是敬虔主义的分支，如圣洁会、五旬节派、灵恩派、拿撒勒派、灵召会等等。敬虔主义的一个很大的特色就是主张彻底的政教分离，该教派的创始人之一施本尔（Philinn Jacob Spener）把政教合一称为凯撒教宗主义，认为是天主教的恶劣传统。另一位创始人亲岑多夫（Count Von Zinzendorf）主张，国家不能强制宗教信念或习俗，良心具有完全的自由，政府与教会应该完全独立。

新教的再洗礼派是激进的政教分离和信教自由的主张者。再洗礼派现在在北美也很有影响，它的一些主张现在在新教界都成了理所当然的见解，如成人洗礼、反对教会内迫害异端的做法等等，门诺派教会是他的直接延续。再洗礼派把政教合一称为君士坦丁主义，认为任何教会与政府的官方关系都是不合法的，因为耶稣和使徒从头到尾都没有认可这种关系。

此外，灵修派以及现在仍有较大影响的一神论派等，都对政教分离的原则做过阐述。